一維固相pH梯度等電聚焦與生物質(zhì)譜聯(lián)用鑒定混合蛋白質(zhì)的方法建立與應(yīng)用.pdf

1、建立了一種基于一維固相pH梯度等電聚焦電泳(1DIPG-IEF)結(jié)合MALDI-TOF-MS，CapLC-Nanoflow-MS/MS和MALDI-TOF-TOF-MS鑒定混合蛋白質(zhì)的方法。本研究考察了1DIPG-IEF的上樣量、染色方法、重復(fù)性和膠內(nèi)酶切技術(shù)。詳細(xì)比較了5種染色方法的效果，B2法無“酸性端歧視效應(yīng)”，脫色速度快，與質(zhì)譜兼容，在功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究中有應(yīng)用前景。優(yōu)化了IPG膠條的膠內(nèi)酶切實(shí)驗(yàn)技術(shù)。1DIPG-IEF比1DS

2、DSPAGE分離能力高，更適合鑒定蛋白質(zhì)異構(gòu)體。1DIPG-IEF也可無需酶切直接分析膠內(nèi)蛋白質(zhì)。 將上述方法用于人白血病細(xì)胞K562提取物的蛋白質(zhì)鑒定，共鑒定出33個蛋白質(zhì)。12個蛋白質(zhì)與文獻(xiàn)報(bào)道相同。其中用MALDI-TOF-TOF-MS鑒定出18個蛋白質(zhì)；用LC-MS/MS鑒定出16個蛋白質(zhì)，平均由3～5個肽段(最多7個)鑒定一個蛋白質(zhì)，具有較高可信度，適合分析較復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物。 用阿糖胞苷(Ara-c)誘導(dǎo)HL

3、-60細(xì)胞凋亡，用透射電鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。給藥6h后，HL-60細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡特征，24h后HL-60細(xì)胞進(jìn)入凋亡中晚期。構(gòu)建了HL-60細(xì)胞凋亡全過程的1DIPG-IEF差異表達(dá)圖譜。未經(jīng)Ara-c處理的HL-60細(xì)胞的IPG-IEF有49個條帶，經(jīng)Ara-c作用6、12、24、36h后條帶分別減少到30、29、29和28條，約減少40％，堿性蛋白條帶減少幅度大。差異蛋白條帶經(jīng)Denovo測序，鑒定了6個較重要蛋白質(zhì)。其中組蛋白