生物質(zhì)譜新技術(shù)與新方法及其在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用研究.pdf

1、本文工作的主要貢獻(xiàn)為：在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中關(guān)于低豐度蛋白和多肽除鹽、富集的研究方面取得了創(chuàng)新性的進(jìn)展：利用液滴內(nèi)部的“0utwardFlow”過程結(jié)合自制的多功能疏水性聚合物成功實(shí)現(xiàn)了一步高效靶上除鹽與樣品富集直接MALDI—MS分析，并成功應(yīng)用到實(shí)際樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中；同時(shí)利用上述體系，使用陽離子型聚合物成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)低豐度磷酸化肽段的靶上富集與除鹽；首次利用聚合物一無機(jī)納米復(fù)合材料成功實(shí)現(xiàn)了低豐度蛋白質(zhì)／多肽的高效、快速和高回收率富

2、集；參與研制成功了作為高效液相色譜檢測器的電噴霧一四極桿一飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(ESI-Q-TOF-MS)，填補(bǔ)了國內(nèi)空白。 蛋白質(zhì)組學(xué)作為后基因組時(shí)代生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)，近年來得到了蓬勃的發(fā)展，已涉足生命科學(xué)中一系列前沿領(lǐng)域，并成為分析化學(xué)研究領(lǐng)域的最前沿課題。它的內(nèi)容包括分離和分析細(xì)胞與組織的全部蛋白并直接找到一組或幾組功能蛋白，研究它們與功能基因(組)的內(nèi)在聯(lián)系。蛋白質(zhì)組研究具有觀察由多基因事件引起的多蛋白質(zhì)組分整體變化的獨(dú)特優(yōu)

3、勢，更接近生命現(xiàn)象的本質(zhì)，在藥靶研究中具有潛在價(jià)值，可通過對(duì)蛋白質(zhì)性質(zhì)、豐度的考察來揭示它的功能，進(jìn)而找到與人類重大疾病相關(guān)的差異蛋白，使之成為診斷、治療及藥物篩選的靶分子。目前蛋白質(zhì)組已被廣泛用于研究各種疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，并取得了很多重大的成就。 蛋白質(zhì)組學(xué)的科學(xué)研究之所以能夠取得蓬勃的發(fā)展，主要依賴于生物質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展以及高通量分離和分析技術(shù)的突破性進(jìn)步。首先是質(zhì)譜技術(shù)尤其是“軟電離源”技術(shù)——電噴霧和基質(zhì)輔助激光解

4、析離子源的發(fā)展，使之成為檢測微量甚至是痕量蛋白質(zhì)分子的重要手段。高通量、高效的分離技術(shù)和大規(guī)模、高效率、高準(zhǔn)確性地鑒定一個(gè)組織或細(xì)胞乃至亞細(xì)胞中的全部蛋白質(zhì)以及利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記方式與多維分離一串級(jí)質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的蛋白質(zhì)定量分析也已經(jīng)使得生物質(zhì)譜成為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的核心分析技術(shù)。生物信息學(xué)的建立形成了國際性的科學(xué)大協(xié)作。目前，世界各主要國家都不惜巨資進(jìn)行蛋白質(zhì)組的研究。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的進(jìn)一步深入，將對(duì)了解疾病的發(fā)生和藥物的篩選起到?jīng)Q定性的

5、作用。 本文工作主要是在化學(xué)系生物質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)室和生物醫(yī)學(xué)研究院蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心完成的。由于傳統(tǒng)的生物質(zhì)譜技術(shù)平臺(tái)已不足以應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)中低豐度蛋白檢測的要求，所以研究和發(fā)展針對(duì)低豐度蛋白檢測方面的新技術(shù)與新方法尤顯得意義重大，本論文以此為切入點(diǎn)，研究了蛋白質(zhì)組學(xué)分析中如何實(shí)現(xiàn)低豐度蛋白有效富集和除鹽的問題，包括：利用疏水性聚合物微印跡技術(shù)實(shí)現(xiàn)的靶上一步除鹽和樣品富集技術(shù)；開展了靶上磷酸化肽段直接濃縮與除鹽技術(shù)的研究；發(fā)展了利用聚

6、合物一無機(jī)納米復(fù)合材料實(shí)現(xiàn)的低豐度蛋白快速高效富集技術(shù)。又因?yàn)榇?jí)質(zhì)譜的成功鑒定對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)研究也非常重要，所以本論文以一種含有多達(dá)28個(gè)氨基酸的復(fù)雜多肽為對(duì)象研究了如何對(duì)大質(zhì)量多肽進(jìn)行有效的串級(jí)質(zhì)譜全序列分析；本論文作者還參與研制成功了作為高效液相色譜檢測器的高分辯飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。 本論文共分六章，主要內(nèi)容摘要如下： 第一章主要綜述了蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的關(guān)鍵技術(shù)——生物質(zhì)譜相關(guān)技術(shù)的發(fā)展及其在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用。新的“

7、軟電離”方式——基質(zhì)輔助激光解吸電離技術(shù)(MALDI)和電噴霧電離技術(shù)(ESI)的問世、質(zhì)譜質(zhì)量分析器的改善、各種分離技術(shù)如高效液相色譜／毛細(xì)管電泳等和質(zhì)譜的聯(lián)用、穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，使得生物質(zhì)譜已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中無可替代的核心技術(shù)平臺(tái)。生物質(zhì)譜在對(duì)基因工程產(chǎn)物、功能蛋白及疾病相關(guān)蛋白的定性、定量分析中具有無可比擬的優(yōu)越性，在蛋白的相互作用、蛋白質(zhì)的折疊等動(dòng)力學(xué)過程的研究中具有極大的潛力。而蛋白質(zhì)組學(xué)作為一門新興學(xué)科，它

8、的發(fā)展現(xiàn)狀和最新技術(shù)進(jìn)展還包括雙向凝膠電泳技術(shù)、色譜分離技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、酵母雙雜交技術(shù)和串聯(lián)親和純化技術(shù)等。低豐度蛋白的分析與鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)內(nèi)容之一，在生物體中承擔(dān)重要生命活動(dòng)的蛋白往往都是低豐度蛋白，然而其極低的含量給后續(xù)的分析和檢測帶來困難，限制了人們對(duì)它們的研究和認(rèn)識(shí)，因此低豐度蛋白的有效濃縮與除鹽是實(shí)現(xiàn)其準(zhǔn)確分析和鑒定的重要條件，所以本章還綜述了目前針對(duì)低豐度蛋白檢測的技術(shù)，并提出了本課題工作的研究方向。

9、 第二章研究工作主要涉及關(guān)于低豐度蛋白靶上一步除鹽與富集直接MALDI—MS分析的新方法。這部分工作是通過將疏水性聚合物微印跡技術(shù)與基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜聯(lián)用，巧妙利用液滴內(nèi)部的“OutwardFlow”效應(yīng)，結(jié)合自制的多功能疏水性聚合物成功實(shí)現(xiàn)了痕量多肽的靶上一步除鹽與富集。微印跡的疏水性聚合物對(duì)蛋白質(zhì)和多肽有很好的吸附富集效果，但是對(duì)無機(jī)鹽和其他污染物吸附很少，利用固體表面液珠蒸發(fā)過程中的外流作用，被疏水性聚合物吸附的樣

10、品無需額外的洗脫除鹽步驟就可實(shí)現(xiàn)一步除鹽并可直接進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。本方法不僅成功實(shí)現(xiàn)了樣品一步除鹽與富集的特性，而且具有靈敏度高、重現(xiàn)性高、通量高、耐鹽能力強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)和省時(shí)等特點(diǎn)?？蓮V泛用于蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域，大大拓展了疏水性聚合物的應(yīng)用范圍。此工作已顯現(xiàn)出比傳統(tǒng)商業(yè)Ziptip或ZipPlate除鹽、富集系統(tǒng)更優(yōu)秀的特性，并成功應(yīng)用在我們課題組承擔(dān)的國際人類蛋白質(zhì)組人肝計(jì)劃和中國人肝計(jì)劃。 第三章主要闡述了低豐度磷酸

11、化肽段靶上濃縮與除鹽一直接MALDI—MS分析的研究。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾是目前蛋白質(zhì)組研究中的一個(gè)重要課題，目前蛋白質(zhì)組技術(shù)研究的主要目標(biāo)之一是建立一套能快速、有效、高通量地分析鑒定發(fā)生翻譯后修飾的蛋白質(zhì)的方法技術(shù)。而蛋白質(zhì)磷酸化是最常見、最重要的一種蛋白翻譯后修飾方式。蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化幾乎調(diào)節(jié)著生命活動(dòng)的整個(gè)過程，包括細(xì)胞的增殖、發(fā)育和分化、神經(jīng)活動(dòng)、肌肉收縮、新陳代謝、腫瘤發(fā)生等。目前蛋白質(zhì)組學(xué)方法中磷酸化蛋白、肽段的富集技術(shù)

12、主要包括雙向磷酸多肽譜圖法、高分辨率的凝膠電泳法(2DE)、反相高效液相色譜法、固定化金屬親和色譜(IMAC)、抗體富集、化學(xué)標(biāo)汜富集等。磷酸化肽段的質(zhì)譜檢測難點(diǎn)主要在于其豐度低、動(dòng)態(tài)的體內(nèi)磷酸化過程、難于離子化、受其它高豐度的非磷酸化肽段信號(hào)的強(qiáng)烈抑制等原因。本論文采用一種陽離子性聚合物材料，結(jié)合第二章介紹的一步除鹽與樣品富集體系，在靶上有效富集了低濃度磷酸化肽段，大大簡化了樣品富集步驟。本方法可檢測到10fmol／μLβ-酪蛋白中的

13、單磷酸化肽，并可得到很好的串級(jí)質(zhì)譜信息。 第四章研究工作主要涉及一種以納米碳酸鈣球表面原位聚合聚甲基丙烯酸甲酯組合材料(簡稱CaCO：,-PMMA)作為納米吸附劑，進(jìn)行痕量肽及蛋白樣品的富集——伴隨無固態(tài)顆?；|(zhì)輔助激光解析離子源質(zhì)譜直接分析的方法。此聚合物一無機(jī)納米復(fù)合材料可對(duì)蛋白質(zhì)和多肽進(jìn)行快速高效富集，與基質(zhì)輔助激光解吸離子源質(zhì)譜有很好的相容性，吸附了樣品的CaCO．~-PMMA在進(jìn)入質(zhì)譜分析前被巧妙的去核——從而避免固

14、體顆粒對(duì)信號(hào)重現(xiàn)性的影響及其濺射對(duì)質(zhì)譜儀器的損害。本方法操作簡單，快速高效，既避免了常規(guī)吹干富集方法的樣品損失問題，又具有很好的耐鹽性。本方法可廣泛適用于蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)領(lǐng)域，并大大拓展了聚合物一無機(jī)納米復(fù)合材料CaCOa-PMMA的應(yīng)用范圍。 第五章主要介紹了對(duì)含有28個(gè)氨基酸的復(fù)雜多肽的串級(jí)質(zhì)譜全序列分析研究。對(duì)于含有太多氨基酸片斷(大于20個(gè))的多肽，很難利用傳統(tǒng)的“從頭測序”(denovosequencing)方法進(jìn)行測序

15、，一方面，由于含有較多氨基酸，得到的串級(jí)質(zhì)譜圖往往碎片信息不完整，對(duì)譜峰歸屬造成很大困難，另一方面即使獲得了較為完整的串級(jí)質(zhì)譜圖，實(shí)驗(yàn)室的服務(wù)器電腦無法對(duì)如此復(fù)雜的碎片峰進(jìn)行合理歸納，往往會(huì)造成電腦超負(fù)荷運(yùn)算陷入死循環(huán)。本章不僅利用串級(jí)質(zhì)譜圖成功鑒定了一種人工合成寡肽(28個(gè)氨基酸)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，并且詳細(xì)考察了不同類型質(zhì)譜儀器、不同碎裂方式、不同碎裂能量、不同激光能量、不同分析軟件對(duì)于測序結(jié)果的影響，討論了含有超過20個(gè)氨基酸片斷的多肽獲

16、得合格串級(jí)質(zhì)譜的條件，也為蛋白質(zhì)組學(xué)研究工作如何制定有效的串級(jí)質(zhì)譜策略提供了有力參考。 第六章主要闡述了作為高效液相色譜檢測器的四極桿——飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(O-TOF—MS)的研制工作。我們使用三組功能不同的四極桿調(diào)制和傳輸離子，采用正負(fù)雙脈沖推斥和離子垂直引入的方式將離子束引入到經(jīng)過優(yōu)化設(shè)計(jì)的二級(jí)有網(wǎng)式反射器，配合新穎的MCP安裝方法和離子檢測技術(shù)，并使用先進(jìn)的三級(jí)真空系統(tǒng)，最終實(shí)現(xiàn)了高靈敏度以及FWHM=i1000的高分辨。