腦缺血再灌注PIAS3酪氨酸磷酸化及其分子機制的研究.pdf

1、目的：PIAS(protein inhibitor of activated STAT)蛋白家族不但可作為SUMO連接酶促進(jìn)底物發(fā)生SUMO化，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的活性，也可作為構(gòu)架蛋白，采用SUMO非依賴的方式，形成激活或抑制復(fù)合物來調(diào)節(jié)蛋白活性和功能。但是PIAS蛋白功能調(diào)節(jié)的機制目前還少有報道。蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式很多，其中酪氨酸磷酸化修飾起到非常重要的作用。本室前期研究結(jié)果表明(1)Src激酶可以和PSD-95結(jié)合，(2)PIAS

2、3可以和PSD-95結(jié)合。PSD-95作為腳手架蛋白，可以募集PIAS3和Src激酶，從而使后兩者有在空間結(jié)構(gòu)上發(fā)生相互作用的可能。因此，本課題擬研究Src激酶對PIAS3的酪氨酸磷酸化，并針對其分子機制展開研究。
　　方法：采用SD大鼠四動脈結(jié)扎全腦缺血模型，分別給予SD大鼠側(cè)腦室注射PP2(15μg)和PP3(15μg)來觀察Src對PIAS3酪氨酸磷酸化的作用；側(cè)腦室注射PSD-95反義寡核苷酸(10 nmol)和錯義寡核苷

3、酸(10 nmol)來觀察PSD-95對PIAS3酪氨酸磷酸化的調(diào)控作用。采用免疫印跡方法檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，應(yīng)用免疫共沉淀方法檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用。采用激光共聚焦檢測PIAS3亞細(xì)胞定位情況。
　　結(jié)果：1.大鼠全腦缺血0.25 h再灌注0.25 h，免疫共沉淀及免疫印跡結(jié)果表明PIAS3酪氨酸磷酸化水平升高。2.SD大鼠側(cè)腦室注射PP2(Src激酶抑制劑)能抑制腦缺血再灌注誘導(dǎo)的PIAS3酪氨酸磷酸化水平的升高。將PIA

4、S3質(zhì)粒與Src質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到COS7細(xì)胞中后，采用激光共聚焦技術(shù)檢測兩者定位情況。結(jié)果顯示，單轉(zhuǎn)染PIAS3質(zhì)粒，PIAS3主要表達(dá)在核中；共轉(zhuǎn)染PIAS3質(zhì)粒與Src質(zhì)粒，PIAS3主要表達(dá)在胞漿中，并且與Src存在共定位。3.大鼠全腦缺血0.25 h再灌注1h，免疫共沉淀及免疫印跡結(jié)果表明，PIAS3與Pyk2結(jié)合水平升高。4.SD大鼠側(cè)腦室注射PSD-95反義寡核苷酸能明顯抑制腦缺血再灌注誘導(dǎo)的PIAS3酪氨酸磷酸化水平的升高。將

5、PIAS3質(zhì)粒與PSD-95質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到COS7細(xì)胞中后，采用激光共聚焦技術(shù)檢測兩者定位情況。結(jié)果顯示，單轉(zhuǎn)染PIAS3質(zhì)粒，PIAS3主要表達(dá)在核中；共轉(zhuǎn)染PIAS3質(zhì)粒與PSD-95質(zhì)粒，PIAS3主要表達(dá)在胞漿中，并且與PSD-95存在共定位。5.將野生型PIAS3(PIAS3 WT)及其酪氨酸點突變體Y270F和模擬酪氨酸磷酸化的點突變體Y270D分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入COS7細(xì)胞中，采用激光共聚焦技術(shù)檢測其定位情況，發(fā)現(xiàn)PIAS3 WT