早期生長反應因子-1在小鼠近視眼形成中的研究.pdf

1、中南大學博士學位論文早期生長反應因子1在小鼠近視眼形成中的研究姓名：蔣晶晶申請學位級別：博士專業(yè)：眼科學指導教師：劉雙珍20100501博上學位論文中文摘要第二章含小鼠Egr1shRNA慢病毒載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染小鼠視網(wǎng)膜的研究目的構(gòu)建含綠色熒光蛋白(GFP)和小鼠早期生長反應因子1(Egr1)發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA干擾(shRNA)共表達的慢病毒載體，并將其轉(zhuǎn)染至小鼠視網(wǎng)膜組織，探索合適的給藥方式。方法將前期實驗已經(jīng)篩選確定的小鼠Egr。1基因sh

2、RNA有效靶序列的質(zhì)粒，命名為LVshRNA(Egr1)。將LVshRNA(Egr1)重組質(zhì)粒及pHelperl0、pHelper20慢病毒包裝用的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝產(chǎn)生慢病毒載體，經(jīng)梯度稀釋后，根據(jù)熒光顯微鏡下綠色熒光蛋白(GFP)表達陽性細胞來計算病毒滴度。將包裝好的慢病毒載體分別通過玻璃體腔和視網(wǎng)膜下注射的途徑轉(zhuǎn)染至C57BL／6小鼠視網(wǎng)膜，于實驗后2周，取小鼠眼球制作冰凍切片，熒光顯微鏡觀察視網(wǎng)膜GFP表達情況。結(jié)

3、果①成功構(gòu)建含GFP并攜帶靶向小鼠Egr1基因的shRNA慢病毒載體，經(jīng)孔稀釋法測定病毒滴度為4108TU／ml；②利用該慢病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染小鼠視網(wǎng)膜組織，發(fā)現(xiàn)經(jīng)玻璃體腔注射途徑轉(zhuǎn)染后的小鼠，GFP廣泛分布于視網(wǎng)膜全層包括視網(wǎng)膜色素上皮層(ROE)；而經(jīng)視網(wǎng)膜下注射途徑轉(zhuǎn)染后的小鼠，GFP局限分布于視網(wǎng)膜外層。結(jié)論成功構(gòu)建含GFP并攜帶靶向小鼠Egr一1基因的shRNA慢病毒載體，通過玻璃體腔注射較視網(wǎng)膜下注射轉(zhuǎn)染效率高，分布范圍廣，為