聚集素蛋白(Clusterin)在心臟移植冷缺血再灌注損傷中的保護作用與機理研究.pdf

1、第一部分供體心臟表達clusterin 顯著降低同基因心臟移植的冷缺血再灌注損傷
　　 目的：心臟移植中冷缺血保存和隨后的熱灌注損傷統(tǒng)稱為冷缺血再灌注損傷，是引起移植物失功的初始因素，而且還可以導致移植心臟冠狀血管病。Clusterin是具有細胞保護功能的伴侶蛋白，幾乎在所有哺乳動物組織中表達，具有參與生殖、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運、抑制補體激活和調(diào)節(jié)凋亡等多種作用。本實驗擬探討供體心臟表達的clusterin在同基因心臟移植冷缺血再灌注損傷中

2、的保護作用及機制。
　　 方法：RT-PCR和免疫組化染色檢測野生型C57BL/6J小鼠（WT B6）和clusterin基因敲除小鼠（CLU-KO，C57BL/6J）心臟組織中的clusterin表達；分別取上述兩組小鼠的心臟，在4℃生理鹽水中保存8h，然后行同基因腹部異位心臟移植；
　　 移植前，分別檢測保存8h后兩組保存液中心肌細胞釋放的肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）含量；移植后15min和24h行心臟移植

3、物評分，評估移植心臟功能；HE染色觀察兩組心臟移植物病理變化；免疫組化檢測兩組心臟移植物內(nèi)髓過氧化物酶（MPO）的表達情況，原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標記法（TUNEL法）檢測兩組心臟移植物內(nèi)的細胞凋亡情況。
　　 結(jié)果：RT-PCR證實WT B6 小鼠心臟組織組成性的表達clusterin，免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，clusterin 蛋白主要表達在血管內(nèi)皮組織和心肌細胞表面，而CLU-KO 小鼠心臟內(nèi)未見clusterin表達。與CL

4、U-KO組相比，WT B6組心臟在4℃生理鹽水中保存8h后，保存液中CK和LDH的釋放量顯著降低（CK：784.25±90.71U/L VS 610.96±60.02 U/L，p=0.0226；LDH：0.744±0.129 VS 0.548±0.076，p=0.0134）。移植后15min和24h，WT B6組心臟移植物評分分別為2.3和3.5，而CLU-KO組心臟移植物評分則分別為1和3，兩者相比，差異顯著，有統(tǒng)計學意義（p=0.0

5、02；p=0.0271）。HE 染色證明，WT B6組心臟移植物血管周圍炎性反應、淋巴細胞浸潤和心肌細胞的壞死均比CLU-KO組減輕。MPO 染色和TUNEL 檢測發(fā)現(xiàn)，WT B6組心臟移植物MPO 陽性細胞數(shù)和凋亡細胞數(shù)較CLU-KO組均顯著減少（p=0.0002；p=0.0316）。
　　 結(jié)論：供心表達clusterin 能顯著降低心臟移植過程中冷缺血再灌注損傷。因此，上調(diào)供移植心臟中的clusterin表達可能具有保護供

6、心并降低冷缺血再灌注損傷的潛能。
　　 第二部分 Clusterin在心肌細胞冷保存損傷中的保護作用及機制
　　 目的：在第一部分實驗中已經(jīng)證實：供心表達clusterin后能減輕冷缺血再灌注損傷。但是，clusterin表達后通過何種機制降低冷缺血再灌注損傷，特別是冷保存損傷，目前尚不清楚。本實驗擬分離clusterin基因敲除（CLU-KO）小鼠心肌細胞，并轉(zhuǎn)入clusterin基因，使心肌細胞表達clusterin

7、，在體外進一步研究clusterin在心肌細胞冷保存損傷中的保護作用及機制。
　　 方法：分離培養(yǎng)CLU-KO 小鼠的心肌細胞，經(jīng)RT-PCR鑒定后，將永生化SV40基因轉(zhuǎn)入心肌細胞，建立小鼠心肌細胞系（MHC）。分別將pHEX6300或pHEX6300-CLU 轉(zhuǎn)染入MHC，獲得MHC-Con和MHC-CLU 兩種細胞，WesternBlot 檢測轉(zhuǎn)染后兩組心肌細胞clusterin 蛋白的表達；兩組心肌細胞在4℃生理鹽水中保

8、存6~ 8h，分別在不同時間點檢測兩組保存液中心肌細胞的LDH 釋放量和細胞膜流動性的改變。
　　 結(jié)果：分離培養(yǎng)的小鼠心肌細胞，經(jīng)RT-PCR鑒定證實，α-心肌肌球蛋白重鏈(α-MHC)和間隙連接蛋白43（connexin 43）表達陽性，而β-心肌肌球蛋白重鏈（β-MHC）和α-骨骼肌肌動蛋白（α-skeletal actin）表達則為陰性。SV40 永生化的小鼠心肌細胞轉(zhuǎn)染pHEX6300或pHEX6300-CLU后，We

9、stern Blot 檢測證明，MHC-CLU表達clusterin 蛋白，而MHC-Con 未見clusterin 蛋白表達。兩組心肌細胞在4℃生理鹽水中保存8h后，MHC-CLU組釋放的LDH 量從1h的22.66±
　　 7.53％升高到8h的28.24±1.78％，而MHC-Con組則從1h的31.39±3.42％升高到8h的92.16±4.07％，兩組間比較，差異顯著，有統(tǒng)計學差異(p＜0.0001)。兩組心肌細胞在4

10、℃生理鹽水中保存6h后，MHC-CLU 膜穩(wěn)定性與0h 相比增加了30％，而MHC-Con 則降低了15％。
　　 結(jié)論：心肌細胞表達clusterin后，通過穩(wěn)定細胞膜，防止冷保存中心肌細胞膜的破裂，并降低心肌細胞LDH釋放，進而抑制心肌細胞壞死，發(fā)揮保護作用。
　　 第三部分重組的clusterin 蛋白（rCLU）在心臟移植冷缺血再灌注損傷中的保護作用及機制
　　 目的：前兩部分的研究結(jié)果證明：（1）供心表

11、達clusterin能顯著降低心臟移植過程中冷缺血再灌注損傷；（2）心肌細胞表達clusterin后，通過穩(wěn)定細胞膜，防止冷保存中心肌細胞膜的破裂，并降低心肌細胞LDH釋放，進而抑制心肌細胞壞死，發(fā)揮保護作用。本研究擬構建重組的clusterin蛋白（rCLU），并將其加入UW保存液中，探討rCLU在人內(nèi)皮細胞系以及小鼠心臟移植中能否發(fā)揮抵御冷缺血再灌注損傷的作用及其潛在的作用機制。
　　 方法：體外合成rCLU并經(jīng)Wester

12、n Blot鑒定。（1）體外實驗：用含不同濃度rCLU的4 ℃UW液分別保存人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）和腎小球內(nèi)皮細胞（HRGECs）；冷保存24h后，分別檢測兩種細胞的LDH釋放量，以確定合適的rCLU濃度。上述兩種內(nèi)皮細胞分別在含1mg/ml rCLU的4℃UW液中保存24h，以相同濃度的牛血清白蛋白（BSA）為陽性對照，F(xiàn)DA-EB法檢測兩種內(nèi)皮細胞的死亡率；流式細胞儀檢測rCLU在兩種細胞表面的結(jié)合率；在不同時間點檢測上述

13、保存體系中，兩種內(nèi)皮細胞細胞膜的流動性改變。（2）體內(nèi)實驗：以C57BL/6J小鼠心臟作為供體，在含1mg/ml rCLU的4℃UW液保存24h，以相同濃度的BSA為陽性對照，不同時間點檢測保存液中心臟釋放的LDH量；供心保存24h后，行同基因腹部異位心臟移植。參照第一部分的實驗方法，移植后15min和24h行心臟移植物評分，評估移植心臟功能；移植后24h，行HE染色檢測心臟移植物病理學變化；免疫組化染色檢測心臟移植物內(nèi)MPO的表達；T

14、UNEL法檢測心肌細胞的凋亡情況。
　　 結(jié)果：Western Blot 鑒定結(jié)果說明合成的rCLU 為異二聚體。體外實驗證明，1mg/ml rCLU的4℃UW 液與相同濃度的BSA 相比，前者能顯著降低HUVECs冷保存過程中的LDH 釋放（29.49±6.07％ VS 88.27±8.3％，P=0.0039）；FDA-EB染色半定量計數(shù)亦表明，1mg/ml rCLU的4℃UW 液能降低冷保存體系中HUVECs的壞死率；流式細

15、胞術檢測證明，rCLU 能夠結(jié)合在HUVECs細胞膜表面，增加細胞膜的流動性；而相同情況下處理的HRGECs，我們也得到了類似的結(jié)果。體內(nèi)實驗證實，1mg/ml rCLU的4℃UW 液能顯著降低小鼠供心在冷保存過程中的LDH 釋放；心臟移植后，rCLU 能有利于心臟移植物功能的恢復并降低血清中CK和LDH 值，同時亦能減輕移植物中血管周圍炎癥、中性粒細胞的浸潤以及心肌細胞的壞死和凋亡。
　　 結(jié)論：rCLU 能保護供移植器官，減