α酮酸加低蛋白飲食抑制腎纖維化的作用及其機制.pdf

1、慢性腎臟病(CKD)是一種常見腎臟疾病，若未能進行有效治療，最終將進入終末期腎臟病(ESRD)。腎纖維化是各種病因導致的CKD發(fā)展至ESRD階段的共同途徑和主要病理結果。氧化應激、慢性炎癥及轉化生長因子β(TGF-β)等細胞因子均在其發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其確切發(fā)病機制尚不清楚。Kruppel樣因子15(KLF15)是一種在體內廣泛分布的核轉錄因子，屬于鋅指蛋白家族，通過對多種基因的表達調控參與細胞分化、增殖、凋亡等生物學過程。20

2、07年Fisch S等研究表明，KLF15參與調控心臟纖維化的發(fā)生，其機制與抑制Ⅰ型膠原轉錄和結締組織生長因子(CTGF)啟動子活性有關。腎纖維化的發(fā)生與心臟纖維化存在相似機制，但目前尚無KLF15與腎臟纖維化關系的研究，其是否是影響CKD腎纖維化發(fā)生及進展的重要因素是本研究的關注方向。
　　 限制蛋白飲食是CKD的主要治療策略之一，可減輕CKD患者氮質血癥，延緩腎衰病情進展，但單純低蛋白血癥可能會引起營養(yǎng)不良等問題。目前臨床常

3、采用低蛋白加α酮酸治療CKD患者，α酮酸可提供必需氨基酸并減少氨基氮的攝入，在不增加體內毒素的同時維持一個相對良好的營養(yǎng)狀態(tài)。但目前仍不清楚低蛋白加α酮酸飲食在延緩CKD病程進展中的作用是否要優(yōu)于單純低蛋白飲食及其具體機制?？紤]到氧化應激、炎癥在CKD腎纖維化中的作用，本研究的目的在于：明確α酮酸加低蛋白飲食是否較單純低蛋白飲食可更好地延緩CKD大鼠腎損害進展，減輕氧化應激、和炎癥在其中的作用，此外，我們還將進一步探討KLF15在腎纖維

4、化進展中的作用和機制。
　　 為此，我們首先建立5/6腎切除SD大鼠CKD模型，對照組大鼠行假手術(Control，n=12)，手術組大鼠分別給予正常蛋白飲食(NPD，n=15)、低蛋白飲食(LPD，n=15)和低蛋白飲食加α-酮酸(LPD+KA，n=15)，干預6個月留取血、尿標本后處死大鼠，進行血、尿生化檢測；留取腎組織包埋切片，進行Masson染色、電鏡、Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白免疫組織化學檢測；提取腎組織總RNA，進行Re

5、al-time PCR檢測TGF-β1、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原和纖維連接蛋白的表達。結果顯示，血尿素氮、尿蛋白、Masson染色病理評分、電鏡、膠原染色和纖維化相關的Real-time PCR均顯示：與對照組相比，NPD組出現(xiàn)明顯的腎功能惡化，LPD較NPD可改善病情進展，而LPD+KA對腎功能的保護作用較LPD更明顯(P＜0.05)。LPD組出現(xiàn)低體重、低血清白蛋白等營養(yǎng)不良的表現(xiàn)，而LPD+KA組未出現(xiàn)明顯的營養(yǎng)不良(P＜0.

6、05)。由于已有研究證實，蛋白營養(yǎng)不良可致組織氧化應激和炎癥水平的增加，而氧化應激和炎癥是CKD腎纖維化的發(fā)生和進展的重要因素，因此，低蛋白加α酮酸飲食較單純低蛋白飲食更好地減緩腎損害進展，其作用可能與改善營養(yǎng)不良，減少氧化應激和炎癥反應有關。
　　 為進一步證實氧化應激和炎癥在低蛋白加α酮酸飲食在延緩CKD病程進展中的作用，我們進一步檢測了各組的氧化應激和炎癥的相關指標。將上述大鼠腎組織行組織勻漿檢測SOD、MDA，提取總蛋白

7、行oxybolt檢測蛋白氧化水平，同時組織切片進行硝基化酪氨酸和CD68免疫組織化學檢測。此外還提取腎組織總RNA，采用Real-time PCR檢測TNF-α、MCP-1、RANTES和CXCL-1的mRNA表達。結果顯示，LPD組和LPD+KA組氧化應激(MDA、硝基化酪氨酸、oxybolt)和炎癥(CD68、TNF-α、MCP-1、RANTES、CXCL-1)相關指標較NPD組顯著改善，同時，LPD+KA組相關指標也顯著好于LPD

8、組(P＜0.05)。這些結果表明，低蛋白加α酮酸飲食通過減輕氧化應激和炎癥反應而減緩CKD腎損害進展。
　　 隨后，我們研究了KLF15在腎纖維化中的作用。首先通過對上述大鼠腎組織的免疫熒光和Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，KLF15主要在對照組腎組織的系膜細胞和間質成纖維細胞中表達，5/6腎切除后表達顯著下降，予以低蛋白和低蛋白加α酮酸飲食可使其表達增加，且LPD+KA組較LPD組增加更為顯著(P＜0.05)。體外實驗中我

9、們采用TGF-β1、TNF-α和H202干預大鼠系膜細胞(RMCs)，提取總RNA行Real-timePCR檢測發(fā)現(xiàn)干預后KLF15表達降低(P＜0.05)；同時通過對TNFR1-/-小鼠系膜細胞及NF-κB基因敲除的RelA-/-小鼠胚腎間質成纖維細胞(MEF)進行TNF-α干預，Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)TNF-α通過TNF受體1和NF-κB途徑減少KLF15表達。為進一步研究KLF15與纖維化的關系，我們將KLF15質粒瞬

10、時轉染人胚腎細胞(HEK293)和RMCs細胞，提取總RNA行Real-time PCR和提取細胞蛋白及上清行ELISA檢測，結果顯示過表達KLF15可顯著減少HEK293和RMCs細胞纖維連接蛋白和Ⅳ型膠原的表達(P＜0.05)。此部分結果表明KLF15參與調控腎纖維化進程，飲食干預可通過影響KLF15表達而延緩CKD進展。
　　 總之，本研究發(fā)現(xiàn)α酮酸加低蛋白飲食較單純低蛋白飲食可顯著地延緩CKD大鼠腎損害進展，其作用與降低