樹突狀細(xì)胞在生命早期變應(yīng)原免疫干預(yù)中的作用.pdf

1、研究背景與目的：
　　變應(yīng)性鼻炎（Allergic rhinitis，AR）被認(rèn)為是一個(gè)全球性的健康問(wèn)題，導(dǎo)致巨大的社會(huì)負(fù)擔(dān)。然而，AR的發(fā)病機(jī)制目前并沒有完全闡明，對(duì)其治療也并不十分理想，各種療法均存在一定局限。因此，對(duì)AR早期預(yù)防方面的研究是目前的一個(gè)熱點(diǎn)，生命早期變應(yīng)原免疫干預(yù)是其中值得關(guān)注的一個(gè)方向。
　　在臨床實(shí)踐中，變應(yīng)原特異性免疫治療通過(guò)變應(yīng)原不同劑量刺激而實(shí)現(xiàn)。其中大劑量變應(yīng)原可誘導(dǎo)良好的免疫耐受，而小劑量變

2、應(yīng)原則沒有顯著效果，提示不同劑量的變應(yīng)原作用可產(chǎn)生不同的免疫效應(yīng)。近年來(lái)，一些研究表明，生命早期的環(huán)境變應(yīng)原暴露可能影響未來(lái)變應(yīng)性疾病的發(fā)展。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，生命早期高濃度的變應(yīng)原暴露對(duì)將來(lái)變應(yīng)性疾病發(fā)生可能具有保護(hù)作用，但具體機(jī)制卻不明確，也缺乏這方面的研究。眾所周知，變應(yīng)原進(jìn)入機(jī)體，首先為抗原呈遞細(xì)胞（antigen-presenting cell，APC）所吞噬，加工處理成抗原肽的形式，將其呈遞給初始T細(xì)胞，從而介導(dǎo)T細(xì)胞的分化

3、。研究表明，樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）在受到外界刺激因素及局部微環(huán)境等的影響下，呈現(xiàn)不同的成熟分化狀態(tài)。變應(yīng)原的劑量差異亦有可能作為一種外界干擾因素，對(duì)DC成熟狀態(tài)造成影響。而最新的一些研究也表明，DC的不同成熟狀態(tài)對(duì)T細(xì)胞分化方向可有極大影響。因此，我們認(rèn)為DC可能在生命早期變應(yīng)原干預(yù)中扮演關(guān)鍵角色。
　　在我們的設(shè)計(jì)中，變應(yīng)原劑量作為唯一的差異因素，所形成的T細(xì)胞免疫記憶方向卻不同。而變應(yīng)原只可能先通過(guò)D

4、C的抗原呈遞作用，才能觸發(fā)后續(xù)的反應(yīng)。因此極有可能是不同劑量變應(yīng)原免疫干預(yù)后，通過(guò)影響DC的不同成熟狀態(tài)，進(jìn)而對(duì)T細(xì)胞分化方向及后期的免疫效應(yīng)造成影響。鼻腔黏膜中含有豐富的 APC（主要是DC)和CD4+T輔助細(xì)胞，而目前認(rèn)為AR的發(fā)病機(jī)制與T細(xì)胞相關(guān)亞群功能平衡失調(diào)密切相關(guān)。因此，DC作為體內(nèi)最重要的APC，在AR的發(fā)病機(jī)制中必然占有非常重要的地位。在生命早期高濃度變應(yīng)原暴露可能具有保護(hù)作用這一現(xiàn)象基礎(chǔ)上，我們?cè)O(shè)想在生命早期予以一定劑

5、量變應(yīng)原主動(dòng)免疫干預(yù)，使機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，從而特異性地預(yù)防相應(yīng)變應(yīng)原后期接觸致敏，抑制AR的發(fā)生。
　　本文將在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中探索不同劑量卵清蛋白（OVA）早期致敏小鼠對(duì)其成年后免疫功能的影響，然后在體外試驗(yàn)中研究不同劑量OVA對(duì)DC成熟狀態(tài)的影響及此后對(duì)初始T細(xì)胞分化方向的影響，從而為生命早期變應(yīng)原干預(yù)提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.不同劑量OVA刺激幼年小鼠對(duì)其成年時(shí)免疫狀態(tài)的影響
　　BALB/c乳鼠出

6、生后的第1、8、15天給予不同劑量OVA（10μg、1000μg）致敏，第5周OVA激發(fā)，一周后處死獲取標(biāo)本。設(shè)對(duì)照組，致敏用生理鹽水或氫氧化鋁，激發(fā)用生理鹽水。ELISA檢測(cè)血清中OVA特異性IgE、IgG1和IgG2a水平以及脾單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4、IL-10和IFN-γ的含量。
　　2.不同劑量OVA對(duì)樹突狀細(xì)胞成熟狀態(tài)的影響
　　BALB/c雌性小鼠，獲取骨髓細(xì)胞，在體外用GM-CSF+IL-4聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)骨

7、髓源性樹突狀細(xì)胞(BMDC)。培養(yǎng)至第六天，用不同劑量OVA（0、0.1、1、10、100、1000、10000μg/ml）刺激，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，收集懸浮和半貼壁細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其中DC表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和主要組織相容性復(fù)合物分子Ⅱ（MHCⅡ）的表達(dá)水平。
　　3.樹突狀細(xì)胞的成熟分化狀態(tài)對(duì)初始T細(xì)胞分化方向的影響
　　BALB/c雌性小鼠,獲取骨髓細(xì)胞，在體外用GM-CSF+IL-4聯(lián)合誘導(dǎo)培

8、養(yǎng)BMDC。培養(yǎng)第六天，用不同劑量OVA（0、10、1000、10000μg/ml）刺激未成熟樹突狀細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。取BALB/c雌性小鼠淋巴結(jié)，磁珠分選獲得初始T細(xì)胞。收獲樹突狀細(xì)胞，與分選之初始T細(xì)胞混合培養(yǎng)72小時(shí)，流式檢測(cè)各組CD4+Foxp3+，CD4+T-bet+和CD4+Gata3+細(xì)胞比例。
　　結(jié)果：
　　1.不同劑量OVA刺激幼年小鼠對(duì)其成年時(shí)免疫狀態(tài)的影響
　　不同劑量OVA早期致敏小鼠后

9、，6周齡時(shí)小劑量組小鼠血清中OVA特異性IgE明顯高于對(duì)照組和大劑量組；大劑量組OVA特異性IgE與對(duì)照組間無(wú)顯著性差異。小劑量組血清OVA特異IgGl相對(duì)高于大劑量，而OVA特異性IgG2a則相對(duì)低于大劑量組。同時(shí)，脾單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，小劑量組IFN-γ/IL-4比值低于對(duì)照組，呈現(xiàn)明顯的Th2方向反應(yīng)，而大劑量組中則表現(xiàn)為Thl方向：IFN-γ/IL-4明顯高于對(duì)照組。
　　2.不同劑量OVA對(duì)樹突狀細(xì)胞成

10、熟狀態(tài)的影響
　　培養(yǎng)6天后，CD11c+細(xì)胞比例均大于80％。OVA刺激24小時(shí)后，OVA劑量為0、0.1、1和10μg/ml，樹突狀細(xì)胞成熟表型CD40、CD80、CD86和MHCⅡ均無(wú)明顯差異。但當(dāng)OVA劑量達(dá)到100及以上時(shí)，各表型表達(dá)均明顯提高，且均隨劑量增大而提高。
　　3.樹突狀細(xì)胞的成熟分化狀態(tài)對(duì)初始T細(xì)胞分化方向的影響
　　分選細(xì)胞中，CD4+CD62L+細(xì)胞比例均大于92%。混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)

11、后發(fā)現(xiàn)：0和10μg組CD4+Gata-3+細(xì)胞比例明顯較高；1000μg組CD4+T-bet+細(xì)胞比例明顯較高；而10000μg組CD4+Foxp3+細(xì)胞比例明顯增高，CD4+Gata-3+和CD4+T-bet+細(xì)胞比例則均明顯下降。
　　結(jié)論：
　　總之，我們?cè)趧?dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)：新生小鼠給予小劑量OVA刺激時(shí)，成年后表現(xiàn)出Th2優(yōu)勢(shì)的免疫反應(yīng)；而大劑量OVA刺激時(shí)，則形成Thl優(yōu)勢(shì)的免疫反應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在一定范圍內(nèi)，不