超聲微泡造影劑介導(dǎo)p53基因轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細胞的基礎(chǔ)研究.pdf

1、宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率僅次于乳腺癌而居第二位。其治療方式主要包括：手術(shù)治療、放療、化療、免疫治療、熱療等。基因治療是目前研究的熱點,但基因載體問題是其發(fā)展的瓶頸。超聲微泡造影劑作為一種新型的基因轉(zhuǎn)染載體可實現(xiàn)安全、高效及靶向性的基因轉(zhuǎn)染。本文通過體外實驗研究超聲微泡造影劑攜帶野生型p53基因轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細胞的轉(zhuǎn)染效率并探討wtp53基因?qū)eLa細胞的作用效果。本研究分三部分：
　　 第一部分：

2、　　 目的：探討一定超聲強度作用下,微泡濃度對HeLa細胞生長活性的影響,以期得到最優(yōu)的超聲微泡參數(shù)組合,為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：將HeLa細胞分為8個實驗組,分別加入1％、5％、10％、20％的微泡濃度,每種微泡濃度分別給予0.5W/cm2,30s和0.75W/cm2,30s兩種不同強度的超聲輻照,MTT法檢測不同超聲微泡濃度對HeLa細胞生長活性的影響。
　　 結(jié)果：超聲輻照0.5 W/cm2,30s時,

3、1％、5％、10％、20％的微泡濃度所對應(yīng)的細胞存活率分別為(94.25±0.76)％、(86.78±0.87)％、(82.41±1.81)％、(62.72±1.71)％:超聲輻照0.75 W/cm2,30s時,1％、5％、10％、20％的微泡濃度所對應(yīng)的細胞存活率分別為(92.59±1.32)％、(84.00±0.69)％、(75.74±0.44)％、(59.35±0.58)％。
　　 結(jié)論：超聲微泡聯(lián)合作用對HeLa細胞的增

4、殖具有抑制作用,且隨著微泡濃度的增大,超聲強度的增加,對細胞的殺傷力明顯增強。為了提高基因轉(zhuǎn)染效率,在不明顯影響細胞生長活性的前提下,我們選擇0.5 W/cm2,30s的超聲輻照,10％的微泡濃度作為后續(xù)基因轉(zhuǎn)染實驗的條件。
　　 第二部分：
　　 目的：以第一部分所篩選出的超聲微泡優(yōu)化參數(shù)為實驗條件,即O.5W/cm2,30s的超聲輻照,10％微泡濃度,對宮頸癌HeLa細胞進行p53基因轉(zhuǎn)染,并與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法進

5、行轉(zhuǎn)染效率的比較。
　　 方法：將HeLa細胞分為5組,以不同方法轉(zhuǎn)染p53基因:A.質(zhì)粒組；B.質(zhì)粒+超聲組；C.質(zhì)粒+超聲+微泡組；D.質(zhì)粒+脂質(zhì)體組；E.空白對照組。培養(yǎng)24-48h后,用熒光顯微鏡下細胞計數(shù)的方式比較各組的轉(zhuǎn)染效率,RT-PCR對p53 mRNA表達進行半定量分析。
　　 結(jié)果：⑴熒光顯微鏡下C組和D組均見較多明亮的綠色熒光細胞,兩組轉(zhuǎn)染率相比,C組高于D組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),B組

6、僅見極少量熒光細胞,A組和E組幾乎見不到熒光細胞。⑵RT-PCR顯示C組和D組可見明亮的特異性p53電泳條帶,C組的p53/β-actin光密度比值較D組大,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其余各組未檢測到相應(yīng)電泳條帶。
　　 結(jié)論：適當濃度的微泡造影劑聯(lián)合優(yōu)化的超聲輻照可有效地介導(dǎo)外源性p53轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細胞,其轉(zhuǎn)染效率高于傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法。超聲微泡作為一種新型的轉(zhuǎn)染載體,可實現(xiàn)較為高效的基因轉(zhuǎn)染。
　　

7、第三部分：
　　 目的：探討采用不同方式轉(zhuǎn)染wtp53基因后,對HeLa細胞生長活性的影響。
　　 方法：將HeLa細胞分為5組,以不同方法進行wtp53基因轉(zhuǎn)染:A.質(zhì)粒組；B.質(zhì)粒+超聲組；C.質(zhì)粒+超聲+微泡組；D.質(zhì)粒+脂質(zhì)體組；E.空白對照組。培養(yǎng)24-48h后,MTT法檢測HeLa細胞的增殖抑制情況,流式細胞儀檢測細胞周期。
　　 結(jié)果：⑴MTT檢測顯示轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h,各組細胞的增殖

8、均受到抑制,其中質(zhì)粒+超聲+微泡組細胞受抑制程度最明顯,且隨時間延長,抑制率逐漸增大。⑵流式細胞儀檢測顯示,與空白對照組相比,C組和D組進入G1期的細胞明顯增多,G2期的細胞明顯減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.05)。C組與D組兩者相比,無顯著性差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：轉(zhuǎn)染wtp53對HeLa細胞生長具有較明顯的抑制作用,超聲微泡介導(dǎo)轉(zhuǎn)染所引起的細胞增殖抑制程度最明顯；質(zhì)粒+超聲+微泡、質(zhì)粒+脂質(zhì)體兩