2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、本研究旨在:通過觀察超聲介導(dǎo)MBCA對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的作用,靜脈注射USMBCA對大鼠心肌組織毛細(xì)血管及肌纖維的作用,以及使用超聲介導(dǎo)MBCA對綠色熒光蛋白報(bào)告基因(EPGFP)對HUVEC的轉(zhuǎn)染效率的影響,探討USMBCA是否可以作為基因治療的一種安全、有效的載體及其機(jī)理,應(yīng)用超聲介導(dǎo)MBCA對HUVEC作用各種相關(guān)的適宜參數(shù)。 材料與方法:1.培養(yǎng)細(xì)胞。配制MBCA-聲諾維(SonoVue)。

2、 2.應(yīng)用MTT比色實(shí)驗(yàn)測定不同濃度MBCA對HUVEC活性的影響本實(shí)驗(yàn)分組如下:根據(jù)添加MBCA的濃度不同,分為A組:MBCASonoVue濃度為50mg/ml,每孔加50μl;B組:MBCASonoVue濃度為25mg/ml;每孔加50μl;C組:MBCASonoVue濃度為17mg/ml,每孔加50μl;D組:MBCASonoVue濃度為12.5mg/ml,每孔加50μl;E組:對照組,每孔加生理鹽水50μl;F組:空白對照組,

3、不加細(xì)胞及MBCA,每孔加入200μl培養(yǎng)液。以上六組每組重復(fù)8孔。0.25%胰酶消化HUVEC單層培養(yǎng)細(xì)胞,用含10%FBS的1640培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液,以每孔含104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔體積150μl。如上所述,每組加入不同濃度的MBCA。進(jìn)行超聲輻照后,培養(yǎng)細(xì)胞20小時(shí),然后每孔加入MTT溶液10μl,37℃繼續(xù)孵育4小時(shí),終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每空加入二甲基亞楓(DMSO)150μl,振蕩10分鐘。選49

4、0nm波長,在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值,記錄結(jié)果。整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。MTT測細(xì)胞活性,加入0.9%Nacl組的細(xì)胞存活率為100%,每組各孔細(xì)胞的存活率為:每組各孔細(xì)胞的吸光值與加入0.9%Nacl組各孔細(xì)胞的吸光值的比值的百分比。 3.不同濃度MBCA對HUVEC凋亡及活性的影響用含10%FBS的1640培養(yǎng)液配成HUVEC懸液,計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)將濃度調(diào)至1×106/ml,將1ml細(xì)胞懸液接種到直徑35mm單孔聚乙烯培養(yǎng)皿中

5、。根據(jù)添加MBCA的濃度不同,分為A組:MBCASonoVue濃度為50mg/ml;B組:MBCASonoVue濃度為25mg/ml;C組:MBCASonoVue濃度約17mg/ml;D組:MBCASonoVue濃度為12.5mg/ml。以上四組每孔加MBCASonoVue300μl。E組:對照組,每孔加生理鹽水300μl。以上五組每組重復(fù)6孔。超聲輻照后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)。按照Annexin-v-FITC和PI雙標(biāo)記細(xì)胞凋亡檢測試劑

6、盒說明操作,然后用熒光顯微鏡(FMS)觀察加入不同濃度MBCA,HUVEC凋亡和壞死細(xì)胞的情況,F(xiàn)MS下綠色細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞,紅色細(xì)胞為晚期凋亡和死亡細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測每組細(xì)胞凋亡及存活率。 4.超聲介導(dǎo)MBCA對HUVEC細(xì)胞膜的作用實(shí)驗(yàn)分組:A組:正常對照組;B組:單純超聲輻照組;C組:MBCA組,以上各組均為一皿;D組:MBCA+超聲輻照組,兩皿。用含10%FBS的1640培養(yǎng)液配成HUVEC懸液,計(jì)細(xì)胞數(shù)

7、將濃度調(diào)至1×106/ml,將1ml細(xì)胞懸液接種到直徑35mm單孔聚乙烯培養(yǎng)皿中。C組、D組各加濃度為17mg/ml的MBCASonoVue,每孔加300μl。B組、D組用超聲輻照,輻照后立即各組取一皿細(xì)胞送電鏡室進(jìn)行掃描電鏡(SEMS)觀察。D組的另一皿細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行SEMS觀察。 5.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:將16只大鼠隨機(jī)分為4組,每組4只,A組:正常對照組;B組:超聲輻照組,C組:MBCA組;D組:MBCA+超

8、聲輻照組。用10%水合氯醛(1~2ml/kg)對大鼠行腹腔麻醉,之后胸部脫毛。C組、D組大鼠經(jīng)股靜脈輸入含氟碳?xì)怏wMBCA(0.5ml/每只),注射時(shí)間約1分鐘,然后使用HP5500超聲診斷儀,S4探頭在B組、D組大鼠胸壁超聲輻照6分鐘,破壞心肌組織內(nèi)的MBCA。超聲輻照時(shí)采用contrast程序,間歇harmonic成像,探頭發(fā)射頻率為1.8MHz接收頻率為3.6MHz,機(jī)械指數(shù)1.6,聚焦深度4cm,采用心電觸發(fā),每7個(gè)心動(dòng)周期觸發(fā)

9、一次。其余設(shè)置取該程序默認(rèn)值,保持儀器各項(xiàng)設(shè)置在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中不變。透射電鏡(TEMS)觀察:超聲輻照后。立即剪斷大鼠肋骨,取左心室前壁心肌,送電鏡室做TEMS觀察。 6.基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組:本實(shí)驗(yàn)分組如下:A組:HUVEC;B組:HUVEC+EPGFP+Lipofectamine2000;C組:HUVEC+EPGFP+Lipofectamine2000+SonoVue微泡;D組:HUVEC+EPGFP+Lipofectami

10、ne2000+超聲輻照;E組:HUVEC+EPGFP+Lipofectamine2000+SonoVue微泡+超聲輻照。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。用不同條件的超聲輻照。輻照后立即將上述細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí),之后用FMS觀察EPGFP在HUVEC內(nèi)的表達(dá),并且使用FCM測出EPGFP在HUVEC內(nèi)的轉(zhuǎn)染率。 結(jié)果:1.應(yīng)用MTT比色實(shí)驗(yàn),不同濃度MBCA對HUVEC活性的影響不同。超聲介導(dǎo)初MBCA及其稀釋2倍時(shí)細(xì)胞存活率較低;初MBCA

11、稀釋3倍時(shí)細(xì)胞存活率增高,且較前兩者有明顯差異(P<0.01),初MBCA稀釋4倍與稀釋3倍時(shí)比較,對細(xì)胞存活率無顯著影響(P>0.05)。 2.應(yīng)用Annexin-v-FITC和PI雙標(biāo)記細(xì)胞凋亡檢測試劑盒,檢測不同濃度MBCA對HUVEC活性、凋亡及壞死的影響不同。超聲介導(dǎo)初MBCA時(shí)存活細(xì)胞百分比較小,晚期凋亡和壞死細(xì)胞百分比較多;初MBCA稀釋2倍時(shí)存活細(xì)胞百分比增多,晚期凋亡和壞死細(xì)胞百分比減少,較前者有明顯差異(P<

12、0.01);初MBCA稀釋3倍時(shí)存活細(xì)胞百分比進(jìn)一步增大,晚期凋亡和壞死細(xì)胞百分比進(jìn)一步變小,且與初MBCA或其稀釋二倍時(shí)有明顯差異(P<0.01);初MBCA稀釋4倍與稀釋3倍時(shí)比較對細(xì)胞存活、晚期凋亡和壞死百分比無顯著影響(P>0.05)。超聲介導(dǎo)初MBCA稀釋3倍時(shí),早期凋亡細(xì)胞百分比明顯減小,且與初MBCA或其稀釋二倍時(shí)有明顯差異(P<0.01),初MBCA稀釋4倍時(shí)與初MBCA稀釋3倍時(shí)比較對早期凋亡細(xì)胞百分比無顯著影響(P>

13、0.05)。 3.超聲介導(dǎo)MBCA可使大約23%HUVEC的細(xì)胞膜呈現(xiàn)直徑約2微米的小孔,該細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后再進(jìn)行SEMS觀察小孔關(guān)閉,細(xì)胞膜恢復(fù)正常。 4.TEMS觀察,超聲介導(dǎo)MBCA組,大鼠心肌組織毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜破損、溶解,內(nèi)皮細(xì)胞線粒體空泡變性,細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)凝聚;血管壁破裂,可見紅細(xì)胞外溢;心肌纖維斷裂、溶解。 5.EPGFP對HUVEC轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,F(xiàn)MS下實(shí)驗(yàn)組的HUVEC內(nèi)可見特異性

14、EPGFP表達(dá),超聲+微泡組EPGFP表達(dá)量明顯增多。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示,超聲破壞MBCA能明顯提高脂質(zhì)體介導(dǎo)的EPGFP對HUVEC的轉(zhuǎn)染率。 結(jié)論:1.超聲破壞MBCA能明顯提高脂質(zhì)體介導(dǎo)的EPGFP對HUVEC的轉(zhuǎn)染率。USMBCA可作為基因治療的載體。 2.SonoVue可增強(qiáng)超聲的空化效應(yīng),使HUVEC膜上出現(xiàn)可逆性小孔,導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)。空化效應(yīng)是超聲介導(dǎo)MBCA增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染率主要機(jī)制之一。

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