c57小鼠肝組織微粒體蛋白質(zhì)組表達(dá)譜的研究.pdf

1、微粒體是指細(xì)胞勻漿通過差速離心和蔗糖密度梯度離心，去除核組分和線粒體組分后，獲得的由破碎的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自我融合形成的近球形的膜囊泡狀結(jié)構(gòu)。大部分膜囊來自于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，也包括其他膜性細(xì)胞器的成分，如高爾基體、過氧化物酶體、內(nèi)涵體、線粒體外膜、內(nèi)吞小體，以及肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、Kupffer 細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的質(zhì)膜。簡而言之，微粒體代表的是主要來自于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細(xì)胞內(nèi)起著重要作用，除了參與蛋白質(zhì)的合成分泌和修飾加工外，還包括了一大部分參與糖代

2、謝、脂代謝及生物轉(zhuǎn)化的蛋白。因此，微粒體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究有助于闡明蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)和磷脂一蛋白質(zhì)之間的相互作用，蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能以及結(jié)合于膜上的酶的功能特性等。 本研究應(yīng)用差速離心和蔗糖密度梯度離心從c57小鼠(BL-6)肝組織勻漿中抽提得到高純度的微粒體。行Western-b10t實(shí)驗(yàn)以檢驗(yàn)其純度及污染物的含量。直接應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)分離純化

3、后的肝微粒體：同時(shí)考慮到構(gòu)成微粒體的絕大部分為膜組分，而2一DE在膜蛋白的分離方面有較大的困難，因此我們先用Na<,2>CO<,3>抽提出微粒體中的膜蛋白，再用一維SDS—PAGE技術(shù)分離膜蛋白。兩種方法所分離的蛋白均由ESIQ-TOF予以鑒定。并利用生物信息學(xué)資源對(duì)所鑒定蛋白質(zhì)的功能和亞細(xì)胞定位等進(jìn)行分析。 本研究初步建立了c57小鼠肝微粒體蛋白質(zhì)表達(dá)譜。直接對(duì)微粒體進(jìn)行分離的2D參考膠上平均展示點(diǎn)數(shù)為1028±83個(gè)。選取2

4、04個(gè)分辨較好的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定，鑒定出蛋白質(zhì)185個(gè)，其中52個(gè)蛋白通過Swiss-prot數(shù)據(jù)庫檢索被確定為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)固有蛋白。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志性蛋白如GRP94、GRP99、及UDP-葡糖醛酰轉(zhuǎn)移酶1-7前體均得到準(zhǔn)確鑒定。Na<,2>CO<,3>處理后的微粒體膜組分經(jīng)SDS PAGE分離后，ESIQ-TOF鑒定出99個(gè)蛋白，其中59個(gè)為膜蛋白。鑒定出的蛋白中有28個(gè)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志性膜蛋白：細(xì)胞色素P-450和b5，鈣網(wǎng)蛋白，以