強(qiáng)心復(fù)脈方對乳鼠受損竇房細(xì)胞動作電位及鉀電流的電生理機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　 病態(tài)竇房結(jié)綜合征（簡稱病竇，sick sinus syndrome，SSS）是臨床難治性重大心血管疾病，主要表現(xiàn)為持續(xù)的緩慢性心律失常，重者發(fā)生心跳驟停，嚴(yán)重威脅患者生命。目前尚無有效根治SSS措施，西藥治療以阿托品、腎上腺素等藥物提高心率為主，但副作用大，患者難以堅持長期服藥;嚴(yán)重者需植入人工心臟起搏器，而起搏器價格昂貴、壽命短，需定期更換，且易導(dǎo)致感染、導(dǎo)絲斷裂、起搏器綜合征等并發(fā)癥。中醫(yī)藥治療SSS從整體入手

2、，通過多種作用環(huán)節(jié)緩解SSS患者臨床癥狀，提高患者的生活質(zhì)量和生存率，延長壽命。
　　 竇房結(jié)是心臟自律性的發(fā)源地，其起搏功能的正常對維持心臟正常的泵血功能尤為重要。竇房結(jié)起搏細(xì)胞的自發(fā)性動作電位保證了竇房結(jié)自律性的穩(wěn)定，其動作電位的形成有賴于竇房結(jié)細(xì)胞膜上各種離子流綜合作用的結(jié)果，因此任何一種離子通道結(jié)構(gòu)與功能的異常均可導(dǎo)致竇房結(jié)起搏功能異常，從而引發(fā)SSS。
　　 強(qiáng)心復(fù)脈方(QFR)是全國著名老中醫(yī)劉志明從醫(yī)70余

3、年總結(jié)治療SSS的有效原創(chuàng)方。前期大量臨床與基礎(chǔ)研究表明該方療效肯定，可有效改善SSS患者臨床癥狀，提高心率，改善竇房結(jié)自律性和傳導(dǎo)功能，改善竇房結(jié)組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，從整體、組織、分子、基因等不同水平揭示強(qiáng)心復(fù)脈方治療SSS的機(jī)制，但尚未從離子通道學(xué)水平對其細(xì)胞電生理機(jī)制進(jìn)行研究。
　　 目的：
　　 在探索適合于細(xì)胞電生理學(xué)研究的乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞(SNC)分離方法基礎(chǔ)上，成功分離出適合于進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗研究的乳鼠SNC

4、，進(jìn)一步探討QFR含藥血清對乳鼠受損竇房結(jié)細(xì)胞動作電位(AP)相關(guān)參數(shù)及復(fù)極相關(guān)電流(Ito和IKur)的影響，以揭示QFR治療SSS的細(xì)胞電生理機(jī)制，為名老中醫(yī)經(jīng)驗方治療病竇提供科學(xué)依據(jù)，為中藥研究的思路提供借鑒。
　　 方法：
　　 1.以常規(guī)培養(yǎng)法(“酶解+差速貼壁+5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)”)作為對照，探索一種適合于細(xì)胞電生理學(xué)研究的乳鼠SNC分離方法，即“酶解+差速貼壁”法。
　　 2.將采

5、用“酶解+差速貼壁”法分離的乳鼠SNC分為正常組、模型組、100 ul、200 ul、300 ul強(qiáng)心復(fù)脈含藥血清組及100 ul空白血清組，除正常組，其余各組細(xì)胞均模擬缺血-再灌注(I-R)法制備乳鼠SNC損傷模型，并利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察空白血清及強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清對各組SNC自發(fā)性搏動頻率、作電位時程APD20、A PD50、APD90、最大舒張電位(MDP)、動作電位幅值(APA)的影響。
　　 3.將采用“酶解+差速

6、貼壁”法分離的乳鼠SNC分為正常組、模型組、100 ul、200 ul、300 ul強(qiáng)心復(fù)脈含藥血清組及100 ul空白血清組，除正常組，其余各組細(xì)胞模擬I-R法制備SNC損傷模型，并利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察空白血清及強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清對各組SNC瞬時外向鉀電流（Ito）和超速激活延遲整流鉀電流(IKur)電流-電壓曲線及相關(guān)門控機(jī)制的影響。
　　 結(jié)果
　　 1.“酶解+差速貼壁”組與常規(guī)培養(yǎng)組分離的乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞中，

7、鏡下均可觀察到三種形態(tài):梭形、三角形、多邊形，且均為梭形細(xì)胞比例最高，分別為(58.0±3.0)％和（63.6±1.7）％，但兩組差別無統(tǒng)計學(xué)意義。對“酶解+差速貼壁”組細(xì)胞的搏動頻率進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，梭形細(xì)胞和三角形細(xì)胞的搏動頻率分別為（104.4±4.6）次/min和（61.1±1.47）次/min，且梭形細(xì)胞搏動頻率較三角形細(xì)胞快(P＜0.01)，多邊形細(xì)胞無搏動。對兩組中梭形細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗實驗發(fā)現(xiàn)，均可記錄到自發(fā)性動作電

8、位(AP)及超極化激活的環(huán)核苷酸門控陽離子通道電流（If），符合竇房結(jié)起搏細(xì)胞特性。與常規(guī)培養(yǎng)組比較，“酶解+差速貼壁”組細(xì)胞邊緣較整齊，紋理較清晰，細(xì)胞膜的彈性較好，立體感較強(qiáng)?！懊附?差速貼壁”組和常規(guī)培養(yǎng)組進(jìn)行膜片鉗實驗破膜成功率分別為65％和45％。
　　 2.與正常組比較，模擬I-R造模后SNC的自發(fā)性搏動頻率減慢，APD20由(21.6±5.4）ms延長至（77.2±5.5）ms，APD50由（76.7±4.8）ms

9、延長至（147.5±5.1）ms，均具有極顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)，APD90雖有延長，但無統(tǒng)計學(xué)意義。加入100ul強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清后，竇房結(jié)細(xì)胞自發(fā)性搏動頻率加快，分別于造模后細(xì)胞外液加入100ul、200ul、300ul強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清后，APD20分別縮短至（35.7±7.1）ms、（50.1±7.5）ms、（39.7±4.3）ms，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，三組之間無統(tǒng)計學(xué)差異;APD50分別縮短至（90.

10、6±5.8）ms、(111.0±4.1)ms、（109.0±2.4）ms，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，其中100 ul含藥血清組縮短較200 ul、300 ul含藥血清組更明顯(P＜0.05)，但200 ul和300 ul含藥血清組之間無差異;APD90的改變無統(tǒng)計學(xué)意義。100 ul空白血清對造模后SNC的APD20、APD50和APD90均無明顯改變。
　　 3.與正常組比較，模擬I-R造模后SNC最大舒張電位(MD

11、P)由（-61.9±5.4）mV變?yōu)椋?54.5±4.6）mV，動作電位幅值(APA)則由（84.7±5.0）mV降至（71.4±4.7）mV，均具有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。分別于造模后細(xì)胞外液加入100 ul、200 ul、300 ul強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清后，各組MDP均無明顯改變，100 ul和300 ul含藥血清分別使APA升高至（83.2±5.9）mV和(82.2±6.4)mV，具有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），但兩

12、組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義，200 ul含藥血清對造模后SNC的APA雖有升高，但無統(tǒng)計學(xué)差異。100 ul空白血清對造模后SNC的MDP及APA均無明顯影響。
　　 4.正常組SNC的Ito和Ikur峰值電流密度分別為（23.08±2.52）pA/pF和(21.7±2.5) pA/pF，模擬I-R造模后細(xì)胞Ito和IKur峰值電流密度分別降為（14.06±1.23）pA/pF和（14.4±0.9）pA/pF，均具有極顯著性差異(P＜

13、0.01)。分別于造模后細(xì)胞外液加入100 ul、200 ul、300 ul含藥血清后，Ito峰值電流密度分別升高至(18.97±1.96) pA/pF、(20.95±1.12) pA/pF、(21.65±1.73) pA/pF(P＜0.01),三組之間比較，峰值電流密度雖然隨著給藥濃度增加而增加，但無統(tǒng)計學(xué)差異;IKur峰值電流密度分別增大至（17.69±1.92）pA/pF、（18.74±2.03）pA/pF、(20.00±1.57

14、)pA/pF(P＜0.01)，三組之間比較，峰值電流密度雖然隨著給藥濃度增加而增加，但無統(tǒng)計學(xué)差異?？瞻籽褰M與模型組SNC比較，Ito和IKur峰值電流密度無統(tǒng)計學(xué)差異。分別于正常SNC外液加入100 ul強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清及空白血清后，含藥血清組細(xì)胞Ito和IKur峰值電流密度均較正常組有所升高(P＜0.05)，空白血清組細(xì)胞Ito和IKur則無明顯變化。
　　 各組Ito和IKur的電流-電壓(I-V)曲線圖顯示，SNC的

15、Ito和IKur電流隨著電壓向去極化移動，電流密度均增大，且均呈現(xiàn)一定的外向整流特征。模擬I-R造模后，Ito和IKur在各電壓下電流密度均有降低，但電流-電壓曲線形狀基本不變，Ito在+20 mV以上的電壓范圍內(nèi)， IKur在+10 mV～+70 mV的范圍內(nèi)，電流密度降低值有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。于造模后細(xì)胞外液中加入100 ul強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清后，各電壓下電流密度均有不同程度升高，Ito在+10 mV～+70mV范圍內(nèi)及I

16、Kur在+20 mV～+70 mV的范圍內(nèi)，I-V曲線恢復(fù)尤其明顯(P＜0.05)。與模型組比較，100ul空白血清組細(xì)胞Ito和IKur各電壓下電流密度均無明顯變化。于正常SNC外液分別加入100ul含藥血清和空白血清后，含藥血清組Ito和IKur各電壓下電流密度均明顯升高，Ito在+10mV～+70mV范圍內(nèi)有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，IKur在+20mV～+70mV的范圍內(nèi)有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，而空白血清組Ito和IKu

17、r各電壓下電流密度均無明顯改變。
　　 與正常組比較，模擬I-R造模后SNC的Ito和IKur穩(wěn)態(tài)激活曲線均右移，即向去極化方向移動，半激活電壓(V1/2)Ito從正常組的（-8.64±2.25）mV移至（13.14±0.97）mV（P＜0.01），IKur從正常組的（-13.6±1.1）mV移至(-10.34±1.57)mV(P＞0.05)。加入100 ul強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清后，穩(wěn)態(tài)激活曲線均左移，Ito和IKur的V1/2分

18、別變?yōu)椋?3.28±1.66）mV和（-21.71±2.65）mV，與模型組比較差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。Ito和IKur的激活曲線斜率K分別由正常的（11.66±1.93）mV和（9.84±1.11）mV變?yōu)樵炷：蟮模?2.10±0.95）mV(P＞0.05)和（17.60±2.01）mV(P＜0.01)，加入100 ul強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清后，分別變?yōu)椋?0.67±1.43）mV和(15.02±2.13) mV，但差別均無統(tǒng)

19、計學(xué)意義。
　　 與正常組比較，模擬I-R造模后SNC的Ito和IKur穩(wěn)態(tài)失活曲線均左移，V1/2分別從（-39.54±0.61）mV和(-49.17±4.11) mV變?yōu)?-53.93±0.89) mV(P＜0.01)和(-66.67±8.11)mV（P＜0.01），加入100ul強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清后，穩(wěn)態(tài)失活曲線均右移，V1/2分別變?yōu)?-37.33±2.19) mV和（-30.54±4.81）mV，與模型組比較差別均具有

20、統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。失活曲線斜率K分別由正常的(8.14±0.54) mV和(9.02±1.02) mV變?yōu)樵炷：蟮?9.91±0.82) mV和(13.24±1.08) mV，加入100 ul強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清后，分別變?yōu)椋?1.96±2.14）mV和(12.26±0.57) mV，但差別均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 與正常組比較，模擬I-R造模后SNC的Ito通道失活后恢復(fù)曲線無明顯差異，IKur通道失活后恢復(fù)減慢，在前3

21、000 ms表現(xiàn)的尤為突出，加入100 ul含藥血清后，Ito曲線無明顯改變，IKur曲線略有恢復(fù)，但未恢復(fù)到正常范圍。
　　 結(jié)論：
　　 1.與常規(guī)培養(yǎng)法相比，“酶解+差速貼壁”法可成功分離出乳鼠SNC，符合SNC結(jié)構(gòu)和電生理特性，該方法操作步驟簡單，細(xì)胞損傷小、活性好，更適合用于細(xì)胞電生理學(xué)研究，該方法分離的乳鼠SNC為梭形，具有自發(fā)性搏動，可記錄到自發(fā)性動作電位(AP)及超極化激活的環(huán)核苷酸門控陽離子通道電流（I

22、f）。
　　 2.強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清可加快乳鼠受損SNC自發(fā)性搏動頻率，縮短作電位時程APD20、APD50，而對APD90無明顯影響，可增大乳鼠受損SNC的APA，同時可保護(hù)乳鼠受損SNC形態(tài)結(jié)構(gòu)，從而提高心率。
　　 3.強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清能電壓依賴性增大正常及受損乳鼠SNC的Ito和IKur電流密度;加快Ito和IKur通道穩(wěn)態(tài)激活，減慢Ito和IKur通道穩(wěn)態(tài)失活，雙重作用以恢復(fù)降低的Ito和IKur電流密度，以