三種水稻檢疫性病害同步分子檢測(cè)方法的建立.pdf

1、水稻白葉枯病(Rice bacterial leaf blight)、水稻細(xì)菌性條斑病(Rice bacterial leaf streak)和水稻細(xì)菌性谷枯病(Rice panicle blight)分別由白葉枯病菌( Xanthomonas oryzae pv. oryzae)、細(xì)菌性條斑病菌( X. oryzae pv. oryzicola)和細(xì)菌性谷枯病菌(Burkholderia glumae)引起,并主要通過帶菌種子進(jìn)行傳播

2、。2007年,我國把這3種病菌列入進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄。由于快速、靈敏和特異性強(qiáng),普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(SYBR green real-time PCR)被廣泛用于病害的檢測(cè)。然而,針對(duì)X. oryzae pv. oryzae、X. oryzae pv. oryzicola、B. glumae這3種病原同步檢測(cè)的體系仍未見報(bào)道。本論文分別根據(jù)水稻白葉枯病菌的糖基轉(zhuǎn)移酶基因(putative glycosyltransfe

3、rase gene)(NCBI No. AF169030.1)、水稻細(xì)菌性條斑病菌的AvrRxo基因(NCBI No. AY395713.1)和水稻細(xì)菌性谷枯病菌16S rDNA的轉(zhuǎn)錄間隔序列(ITS)(NCBI No. D87080.1)進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì),結(jié)果表明3對(duì)引物特異性強(qiáng),目標(biāo)片段大小分別為230 bp、112 bp和164 bp。對(duì)其靈敏度檢測(cè)表明:常規(guī) PCR對(duì) X. oryzae pv. oryzae、X. oryza

4、e pv. oryzicola和B. glumae DNA的檢測(cè)最低限度分別為1 pg/μl、0.5 pg/μl和1 pg/μl;實(shí)時(shí)熒光定量 PCR對(duì) X. oryzae pv. oryzae、X. oryzae pv. oryzicola和B. glumaeDNA的檢出限分別為1 fg/μl、1 fg/μl和10 fg/μl。
　　多重 PCR可在一個(gè) PCR反應(yīng)內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病菌的特異性擴(kuò)增。本研究建立了對(duì) X. oryzae

5、 pv. oryzae、X. oryzae pv. oryzicola和 B. glumae進(jìn)行同步檢測(cè)的多重 PCR體系;對(duì)多重 PCR靈敏度的檢測(cè)結(jié)果表明,X. oryzae pv. oryzae、X. oryzae pv. oryzicola和B. glumae的檢出限分別達(dá)到0.3 pg/μl、0.167 pg/μl和16.7 pg/μl,與單獨(dú)進(jìn)行 PCR的靈敏度接近。
　　由于沒有獲得自然界中同時(shí)帶有 X. oryza

6、e pv. oryzae、X. oryzae pv. oryzicola和B. glumae這3種病原菌的水稻種子,本研究對(duì)人工接種這3種病原的模擬帶菌種子進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,X. oryzae pv. oryzae、X. oryzae pv. oryzicola和B. glumae均能被檢測(cè)到,且目的片段大小分別為230 bp,164 bp和112 bp。
　　綜上所述,本研究建立了一種利用多重PCR技術(shù)對(duì)3種水稻檢疫性病原進(jìn)行