慢病毒介導的RNA干擾DC-STAMP表達抑制人破骨細胞成熟的實驗研究.pdf

1、目的：骨髓瘤骨病(MBD)是由于破骨細胞和多發(fā)性骨髓瘤(MM)細胞的相互作用而導致進行性的骨質破壞，嚴重影響MM患者的生存質量和預后。樹突狀細胞-特異性跨膜蛋白(DC-STAMP)為鼠源性破骨細胞分化成熟所必需，但其在人類多核破骨細胞形成中作用的研究目前尚屬空白。本實驗研究目的包括：(1)建立完整的人外周血單個核細胞(PBMNC)誘導培養(yǎng)成為成熟破骨細胞的培養(yǎng)方法和鑒定體系；(2)構建并鑒定人DC-STAMP基因的真核表達載體，并分析在

2、293T細胞中的表達情況；(3)構建并鑒定四種編碼針對人DC-STAMP基因shRNA的慢病毒載體，并篩選出特異性抑制DC-STAMP表達的最佳靶點；(4)采用慢病毒介導的RNA干擾技術分析特異性抑制DC-STAMP表達后對人破骨細胞的成熟及其功能的影響，為將來DC-STAMP作為MBD及其它破骨細胞相關疾病的治療靶點提供重要的理論依據。
　　 方法：⑴通過密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞PBMNC后進行貼壁培養(yǎng)，采用巨噬細

3、胞集落刺激因子(M-CSF)和細胞核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)進行誘導培養(yǎng)。通過倒置相差顯微鏡觀察貼壁細胞誘導培養(yǎng)過程中的形態(tài)變化，并用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、牙本質片的骨吸收陷窩情況以及流式細胞儀檢測CD51/CD61表達情況分析破骨細胞的形成和活性。⑵通過反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術體外擴增人類DC-STAMP的cDNA片段，連接入真核表達載體pEGFP-N1-FLAG后進行PCR和測序鑒定，

4、最后用脂質體轉染法將重組質粒pEGFP-DC-STAMP-FLAG轉入293T細胞中，利用倒置熒光顯微鏡和Western blot進行表達鑒定。⑶設計并合成四條DC-STAMP靶向shRNA寡核苷酸序列，分別與pFU-GW載體連接，從而構建編碼DC-STAMP干擾靶點的重組慢病毒表達載體pFU-GW-shRNA1，2，3，4，并進行PCR和測序鑒定。然后分別與第二部分研究所構建的pEGFP-DC-STAMP-FLAG融合基因表達載體共轉

5、染293T細胞，以攜帶陰性對照shRNA的質粒載體為對照，采用Western blot方法篩選出具有高效率RNAi的最佳靶點，最后用脂質體法將含最佳干擾靶點的轉移載體、包裝質粒pHelper1.0和包膜蛋白質粒pHelper2.0共同轉染293T細胞，包裝產生慢病毒顆粒并進行濃縮和測定病毒滴度。⑷首先采用免疫磁珠分選純化人PBMNC中的破骨細胞前體CD14+單核細胞，并用M-CSF和RANKL進行誘導培養(yǎng)，加入表達EGFP的不同復感染指

6、數(MOI=0，5，10，15，20，30)慢病毒液，流式細胞儀檢測慢病毒的感染效率，CCK-8檢測細胞活力狀況。采用實時定量RT-PCR和Western blot分別檢測未感染慢病毒組(Blank組)、攜帶shRNA慢病毒感染組(Lv-shRNA組)和攜帶陰性對照shRNA慢病毒感染組(Lv-NC組)DC-STAMP mRNA和蛋白的表達水平變化，并用TRAP染色觀察各組細胞形態(tài)學，定量測定TRAP活性，甲苯胺藍染色和掃描電鏡觀察牙本

7、質片的骨吸收陷窩情況。
　　 結果：①貼壁的PBMNC經誘導培養(yǎng)后，胞體逐漸增大，形態(tài)各異，單個核細胞通過細胞融合方式形成多核巨細胞。培養(yǎng)14天后的TRAP染色可見巨細胞胞漿內有紫紅色陽性顆粒，多個細胞核，核仁清晰；流式細胞儀分析顯示，細胞表面的CD51/CD61表達較誘導培養(yǎng)前明顯增加，表達率為54.48％。培養(yǎng)21天后甲苯胺藍染色和掃描電鏡均顯示牙本質片上可見明顯的骨吸收陷窩。②應用RT-PCR法可成功擴增出人DC-STAM

8、P全長，片段大小約1430 bp，與預期分子大小相符。重組質粒pEGFP-DC-STAMP-FLAG經PCR和測序證實，DC-STAMP基因已被正確插入表達載體。重組質粒轉染293T細胞24 h后，在倒置熒光顯微鏡下可觀察到高豐度的綠色熒光表達。轉染48 h后的Western blot結果顯示，在轉染重組質粒的293T細胞可檢測到大小約90 kDa的融合蛋白EGFP-DC-STAMP-FLAG表達。③經PCR和測序證實，四條目的shRN

9、A序列均成功連接于慢病毒載體pFU-GW。各重組質粒pFU-GW-shRNA分別與DC-STAMP融合基因表達載體共轉染293T細胞后，Western blot結果顯示shRNA可抑制DC-STAMP融合蛋白的表達。在過表達質粒與慢病毒干擾質粒比例為2∶1和1∶1時，shRNA4的抑制效果最好，抑制率均可達到94％以上。成功包裝和濃縮了含shRNA4和陰性對照shRNA序列的慢病毒顆粒，經測定病毒滴度分別為1.3×109 TU/ml和1

10、.0×109TU/ml。④采用免疫磁珠陽性分選法不僅可獲得高純度(＞90％)的CD14陽性細胞，而且對細胞活力不會造成影響。隨著慢病毒感染量的增加(MOI=0，5，10，15，20，30)，破骨細胞表達EGFP的陽性率也隨之升高，分別為0％，2.75％，38.86％，42.86％，43.22％和45.73％。重復感染(MOI=15)后，Lv-NC組和Lv-shRNA組細胞表達EGFP的陽性率分別為83.51％和82.04％，且慢病毒對細

11、胞活力無造成影響。與Lv-NC組相比較，慢病毒Lv-shRNA感染后，實時定量RT-PCR和Westernblot結果顯示DC-STAMP的mRNA和蛋白質表達水平均明顯下降，抑制效率可達100％，TRAP陽性多核細胞數和TRAP活性顯著降低，骨吸收陷窩也明顯減少，兩組間的差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結論：⑴采用M-CSF和RANKL誘導人PBMNCs分化為具有骨吸收功能的多核成熟破骨細胞的方法是可行的，本培養(yǎng)方

12、法細胞來源豐富，取材容易，培養(yǎng)體系簡單，操作簡便。⑵成功構建了帶EGFP和FLAG雙標記的DC-STAMP融合基因表達載體pEGFP-DC-STAMP-FLAG，并具有在真核細胞中表達的能力，為下一步的實驗奠定了基礎。⑶成功構建并篩選出一個高效且特異阻斷人DC-STAMP表達的RNA干擾慢病毒載體，并包裝出具有較高滴度的慢病毒，將可作為沉默人破骨細胞DC-STAMP基因的有用工具。⑷慢病毒可介導人類破骨細胞高效且長期穩(wěn)定地表達外源性基因