重型肝炎血清的蛋白質(zhì)指紋圖譜研究.pdf

1、我國是病毒性肝炎的高發(fā)區(qū)，由肝炎病毒引起的以肝功能衰竭為主要特征的重型肝炎發(fā)病率很高。重型肝炎通常表現(xiàn)為肝細胞的大面積變性、壞死，最終使肝臟諸多功能喪失殆盡，引起極嚴重的臨床后果。探索重型肝炎的病理生理、新的藥物和治療措施以提高療效，是未來較長時間內(nèi)國內(nèi)外肝病研究的重點之一。 目前已知，重型肝炎患者的臨床表現(xiàn)與體內(nèi)存在嚴重的蛋白合成障礙、代謝紊亂以及有毒物質(zhì)的積聚有關(guān)。肝性腦病的發(fā)生與氨、芳香氨基酸、脂肪酸(主要為短鏈脂肪酸)、

2、硫醇、內(nèi)源性苯二氮卓類物質(zhì)、酚類、假性神經(jīng)遞質(zhì)、γ-氨基丁酸(GABA)等物質(zhì)的異常升高密切相關(guān)。另外，早在30年前，通過色譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)重型肝炎患者血清中有一些異常升高的峰，據(jù)推測，很可能是分子量在5000-500之間的多肽(即中分子物質(zhì))。 除了內(nèi)科藥物治療之外，以清除各種有害物質(zhì)、代償肝臟的代謝功能為目標的人工肝技術(shù)的出現(xiàn)，開辟了重型肝炎治療的新途徑，大大地降低了病死率(近年來，國內(nèi)報道的重型肝炎死亡率為40～50％)，是目前

3、治療重型肝炎的一種重要組成部分。由于肝臟功能的復雜性，目前的人工肝系統(tǒng)尚不能完全替代嚴重病變的肝臟，許多方面的性能均有待優(yōu)化。深入研究重型肝炎的病理生理及各型人工肝的作用特點，是優(yōu)化人工肝系統(tǒng)性能的基礎(chǔ)。 重型肝炎患者經(jīng)內(nèi)科藥物及人工肝治療，病情仍惡化的，要考慮進行緊急肝移植。目前，肝移植治療急性肝功能衰竭的療效確切，病死率可降至20％。然而，由于供肝來源很少，很多患者在等待肝移植期間發(fā)展為不可逆性腦部損傷或因多器官衰竭而死[6

4、]。因此，如何準確判斷重型肝炎的預后，對最大限度利用有限的醫(yī)療資源、實施有效治療至關(guān)重要。 SELDI-TOF-MS(SurfaceEnhancedLaserDesorptionIonization-TimeOfFlight-MassSpectrometry，表面增強激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜)技術(shù)，是隨著蛋白質(zhì)組學的興起而出現(xiàn)的新技術(shù)。該技術(shù)的主體由蛋白質(zhì)芯片、飛行時間質(zhì)譜儀和相關(guān)軟件組成，其中，蛋白質(zhì)芯片是該技術(shù)的核心。由于

5、SEIDI-TOF-MS技術(shù)的高通量特點，能夠反映被檢樣品中一定分子量范圍的蛋白質(zhì)全貌，所以應用SEIDI-TOF-MS技術(shù)得到的質(zhì)譜圖也被稱為蛋白質(zhì)指紋圖譜。SELDI-TOF-MS的技術(shù)特點：(1)集蛋白質(zhì)樣品前處理、分離及檢測分析過程于一體，可對血清及組織粗樣品中的各種蛋白質(zhì)進行直接檢測。(2)特別適合于分析分子量20KDa以下的蛋白質(zhì)，而這一范圍是二維凝膠電泳的分析弱項。 實際上，人類血清中的低分子量蛋白質(zhì)(lowmol

6、ecularweighthumanproteins)或多肽是一個被忽略的、有待開發(fā)的寶庫，可被用于尋找發(fā)病機制的目標蛋白、早期診斷的生物標記物。近年來，隨著SELDI-TOF-MS技術(shù)在癌癥、老年性癡呆、傳染性疾病和心血管疾病研究等方面的應用，越來越多的令人矚目的研究成果表明：人血清中的低分子量蛋白質(zhì)或多肽變化可反映組織的病理生理狀況信息，從而為疾病的監(jiān)測提供有用的生物標記物。 本研究目的：應用SELDI-TOF-MS技術(shù)平臺，

7、研究重型肝炎血清的蛋白質(zhì)指紋圖譜特點，為進一步探討重型肝炎的病理生理打下基礎(chǔ)；同時將所獲得的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜應用于重型肝炎的預后預測。 材料與方法1.材料●標本：76份血清標本——健康對照組22例，病毒性肝炎組54例(其中重型肝炎28例。 ●設備：SELDI-TOF-MS儀(Ciphergeninc.美國)，設置最高分子量為20，000Da，最佳狀態(tài)從1，000Da到10，000Da。 ●芯片：Q10芯片(為強

8、陰離子芯片)、WCX芯片(弱陽離子芯片)、IMAC芯片(金屬親和芯片)、H4芯片(疏水芯片)。 ●數(shù)據(jù)分析工具軟件名稱：ProteinChipsoftware3.1，BiomarkerWizard(Ciphergeninc.美國)：收集蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)； 軟件名稱：SPSS11.0軟件包(SPSSInc.美國)，用于t檢驗、相關(guān)性分析。軟件名稱：MATLAB6.5(TheMathWorksInc.美國)，用于模式識別分析(

9、主成分分析、判別式偏最小二乘法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡) 2.方法●通過對比重型肝炎血清、血漿的蛋白質(zhì)指紋圖譜以及比較不同芯片的蛋白質(zhì)指紋圖譜，篩選出適合本研究的樣品和芯片種類。 ●對54例不同程度肝功能損害的慢性乙型肝炎血清進行蛋白質(zhì)指紋圖譜研究，選綜合性指標MELD分數(shù)評價肝功能，應用Spearman相關(guān)性分析方法，分析各峰的強度與MELD分數(shù)的相關(guān)性。 ●對比22例健康對照組與28例慢性重型肝炎組血清的蛋白質(zhì)指紋圖譜

10、，對重型肝炎血清蛋白質(zhì)指紋圖譜的部分峰特征進行初步分析。 ●將28例重型肝炎分成死亡組與存活組，比較兩組間的蛋白質(zhì)指紋圖譜；用主成分分析方法、判別式偏最小二乘法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡處理數(shù)據(jù)，建立重型肝炎的預后預測模型。 結(jié)果1.研究重型肝炎患者血液的蛋白質(zhì)指紋圖譜時，與血漿相比較，應用血清作為研究對象，能發(fā)現(xiàn)更多的與肝功能損害程度相關(guān)的生物標記物。 2.Q10芯片在檢測重型肝炎血清蛋白質(zhì)指紋圖譜時，較其他芯片更優(yōu)，能發(fā)

11、現(xiàn)更多的有差異的生物標記物；方法穩(wěn)定可靠，具有很好的重復性。 3.研究了54例不同程度肝功能損害的慢性乙型肝炎血清的蛋白質(zhì)指紋圖譜研究，應用MELD分數(shù)評價肝功能，在質(zhì)量電荷比M/Z1000-10000之間，發(fā)現(xiàn)M/Z1065、1224、1237等57個峰的強度與MELD分數(shù)的相關(guān)性P值＜0.000001。 4.對比22例健康對照組與28例慢性重型肝炎組血清的蛋白質(zhì)指紋圖譜，t檢驗分析顯示：在質(zhì)量電荷比M/Z1000-1

12、0000之間，有M/Z1713、6634、1537、1697等59個峰的強度在兩組間的P值＜1×10-5。用主成分分析方法處理數(shù)據(jù)，結(jié)果提示健康對照組與慢性重型肝炎組的劃分邊界非常清楚；應用判別式偏最小二乘法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡處理數(shù)據(jù)，分類正確率達100％。 5.將28例重型肝炎血清按預后的不同分成死亡組與存活組，比較兩組間的蛋白質(zhì)指紋圖譜，t檢驗結(jié)果提示38個峰的強度在兩組間存在顯著差異(P＜0.05)。用主成分分析(Princi

13、pleComponentAnalysis，PCA)方法處理數(shù)據(jù)，結(jié)果提示兩組之間有少數(shù)樣本重疊在一起；應用判別式偏最小二乘法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡處理數(shù)據(jù)，結(jié)果表明所獲得的預后預測模型對重型肝炎預后預測的正確率為85.7～89.3％。M/Z4099、5199、3963、5358、4969在預后預測模型中所占權(quán)重最大。 結(jié)論本研究在國內(nèi)外首次將SELDI-TOF-MS技術(shù)用于重型肝炎(肝功能衰竭)領(lǐng)域的研究，結(jié)果表明：在質(zhì)量電荷比M/Z1

14、000-10000之間，重型肝炎血清中有M/Z1713、6634、1537、1697等59個峰的強度與健康對照組之間存在顯著差異(P＜1×10-5)。為下一步研究重型肝炎的病理生理和治療研究打下了基礎(chǔ)。成功地應用主成分分析、判別式偏最小二乘法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡等模式識別方法，分析重型肝炎血清的蛋白質(zhì)指紋圖譜的數(shù)據(jù)，建立了重型肝炎的預后預測模型，預測的準確率達為85.7～89.3％，并發(fā)現(xiàn)M/Z4099、5199、3963、5358、4969