急性顱腦損傷后腦脊液蛋白質(zhì)指紋圖譜的改變及其意義的研究.pdf

1、引言：顱腦損傷是當(dāng)今威脅人類生命的主要疾患之一，盡管我們對(duì)顱腦損傷的研究不斷深入，但顱腦損傷仍有高傷殘率和高致死率。常規(guī)的顱腦損傷診斷多依賴于CT(X線電子計(jì)算機(jī)斷層掃描)、MRI(磁共振成像)、SPECT(單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描)等神經(jīng)影象學(xué)技術(shù)，這些診斷工具在判定病人的一般腦功能狀態(tài)上是有價(jià)值的，但它們?nèi)狈?duì)腦損傷程度的精確及量化的評(píng)估。在顱腦損傷急性期，是治療干預(yù)最可能起作用的時(shí)候，沒有精確生物標(biāo)記物的評(píng)估嚴(yán)重限制了治療干預(yù)。客

2、觀上要求探索有診斷價(jià)值的生物標(biāo)記物，以彌補(bǔ)GCS評(píng)分和影像學(xué)診斷的不足。 研究表明，原發(fā)的顱腦損傷可引發(fā)一系列分子、細(xì)胞的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生基因蛋白質(zhì)表達(dá)變化，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷或死亡。因此檢測(cè)單一或數(shù)個(gè)指標(biāo)對(duì)顱腦損傷診斷、監(jiān)測(cè)和預(yù)測(cè)預(yù)后，不可避免地存在敏感性和特異性矛盾。蛋白質(zhì)組學(xué)能夠識(shí)別鑒定細(xì)胞、組織或機(jī)體的全部蛋白質(zhì)，提供了一組蛋白質(zhì)的功能及其模式的信息，能夠同時(shí)反映細(xì)胞內(nèi)部的遺傳特性和外界因素的影響的結(jié)果，因此深入研究顱腦損傷

3、的發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，客觀上需要在蛋白質(zhì)組的水平進(jìn)行進(jìn)一步的探索。SELDI-TOF-MS(SurfaceEnhancedLaserDesorption/Ionization-TimeofFlight-MassSpectrometry，表面加強(qiáng)激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜)技術(shù)是最近幾年才發(fā)展起來(lái)的一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，由于SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的高靈敏度及高通量特性，能反映檢測(cè)樣本中蛋白質(zhì)的全貌，從而同時(shí)找到多個(gè)蛋白質(zhì)標(biāo)志物。故我們

4、在本次研究中希望應(yīng)用蛋白質(zhì)指紋圖譜SELDI-TOF-MS技術(shù)，分析腦脊液中的蛋白質(zhì)組在顱腦損傷后表達(dá)的變化，篩選敏感特異的生物標(biāo)志物，試圖發(fā)現(xiàn)可以用于提示病情變化、判斷預(yù)后的生物標(biāo)記物，指導(dǎo)治療的靶標(biāo)。 材料與方法 1病例選擇與分組 組1：輕度顱腦損傷(10)和重度顱腦損傷(9) 19例樣本，輕度顱腦損傷10例，重度顱腦損傷9例。輕度顱腦損傷10例，年齡20-46歲，平均年齡31.5歲，GCS評(píng)分均為1

5、5分，均有昏迷史，昏迷時(shí)間在15分鐘內(nèi)，CT掃描顱內(nèi)無(wú)明顯血腫，臨床診斷為：可疑或少量蛛網(wǎng)膜下腔出血及可疑或輕度腦挫裂傷，腦脊液采樣時(shí)間為傷后18-25小時(shí)。重度顱腦損傷9例，年齡17-39歲，平均年齡30歲，GCS評(píng)分為6-8分，CT掃描顱內(nèi)無(wú)明顯血腫，臨床診斷為：彌漫性軸索損傷，腦脊液采樣時(shí)間為傷后22-25小時(shí)。以上所采集的腦脊液肉眼觀均為淡血性。 組2：重度顱腦損傷(3)和其傷后2天自身對(duì)照(3)及傷后3天自身對(duì)照(3)

6、 重度顱腦損傷3例，GCS評(píng)分為6-8分，CT掃描顱內(nèi)無(wú)明顯血腫，臨床診斷為：彌漫性軸索損傷。腦脊液連續(xù)采樣，時(shí)間為傷后22-25小時(shí)；46-48小時(shí)，70-72小時(shí) 2設(shè)備表面加強(qiáng)激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(SurfaceEnhancedLaserDesorption/Ionization-TimeofFlight-MassSpectrometry，SELDI-TOF-MS)，(PBSII+，CiphergenInc.

7、美國(guó))。主要參數(shù)：收集范圍為1000-100000；優(yōu)化范圍為2000-20000 3芯片H4疏水性表面的化學(xué)芯片 4腦脊液樣本處理對(duì)部分蛋白質(zhì)濃度高的腦脊液樣本根據(jù)其蛋白質(zhì)濃度稀釋，使樣本的蛋白質(zhì)濃度在0.3-0.9mg/ml范圍內(nèi)；96孔蛋白質(zhì)芯片工作平臺(tái)(Bioprocessor)用50ul乙晴預(yù)處理兩次，每次各5分鐘；將腦脊液樣本各取100ul加入Bioprocessor結(jié)合60分鐘；用200ul去離子水沖洗芯片

8、，取出芯片風(fēng)干后點(diǎn)1ul50％SPS兩次，兩次之間放置5分鐘讓其自然風(fēng)干；上機(jī)讀片。 5生物信息學(xué)方法本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用浙江大學(xué)腫瘤研究所的 ZUCI-ProteinChipDataAnalyzeSystem軟件包分析，用支持向量機(jī)方法建立判別模型，用留一法交叉驗(yàn)證作為評(píng)估判別模型效果的方法。特征向量的選取采用統(tǒng)計(jì)過(guò)濾結(jié)合模型依賴性篩選的方法。 5.1初步篩選每組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的m/z；對(duì)每個(gè)質(zhì)荷比峰做Wilconxo

9、n秩和檢驗(yàn)， 5.2生物信息學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，用訓(xùn)練集建立判別模型，用測(cè)試集檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷男Я?；進(jìn)一步篩選用于建模的m/z；選出p值最小的10個(gè)峰進(jìn)一步分析。將10個(gè)峰的任意組合用于支持向量機(jī)模型的輸入，用留一法評(píng)估模型的預(yù)測(cè)效果，選出建立支持向量機(jī)模型預(yù)測(cè)的約登指數(shù)最高的組合作為最終的候選標(biāo)志物， 5.3評(píng)價(jià)各模型測(cè)試集的敏感性、特異性、用留一法交叉驗(yàn)證，每次用除了某一病例外的其余所有病例的數(shù)據(jù)做為訓(xùn)練集建立函數(shù)，再把這一未

10、參與函數(shù)構(gòu)建的病例數(shù)據(jù)做測(cè)試集代入函數(shù)進(jìn)行判別，如此判別每一個(gè)病例。 結(jié)果 1、輕度顱腦損傷和重度顱腦損傷的蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)中25個(gè)m/z，對(duì)每個(gè)質(zhì)荷比峰做Wilconxon秩和檢驗(yàn)，分析得到前10個(gè)m/z強(qiáng)度的的p值都小于0.05，m/z位于8571、13355、8605、4852、6685、2011、5408、8933、2415的蛋白質(zhì)峰。除7612在重度顱腦損傷中低表達(dá)外，其余9個(gè)峰均在重度顱腦損傷中高表達(dá)。

11、 2、將10個(gè)峰的1023種任意組合用于支持向量機(jī)模型的輸入，選出建立支持向量機(jī)模型預(yù)測(cè)的約登指數(shù)最高的組合作為最終的候選標(biāo)志物，它們分別是m/z位于8571、5408的蛋白質(zhì)峰。將19例樣本用留一法交叉驗(yàn)證，重度顱腦損傷的敏感度為100％，輕度顱腦損傷的特異性為100％。 3、重度顱腦損傷的8605M/Z峰，在傷后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)均可檢測(cè)到，且在自身比較中，表達(dá)呈現(xiàn)為明顯的逐漸下降趨勢(shì)。 結(jié)論 1、

12、為了進(jìn)行人顱腦損傷后腦脊液的差異蛋白質(zhì)組表達(dá)譜研究，我們建立了針對(duì)人腦脊液的蛋白質(zhì)組為對(duì)象的，以SELDI-TOF-MS質(zhì)譜技術(shù)、支持向量機(jī)法、留一法交叉驗(yàn)證法等為基礎(chǔ)的技術(shù)平臺(tái)。 2、顱腦損傷可引起腦脊液蛋白質(zhì)表達(dá)譜變化。不同的損傷程度，可產(chǎn)生明顯截然不同的臨床癥狀、病理生理反應(yīng)，直接影響預(yù)后。在急性輕、重度顱腦損傷后24小時(shí)的腦脊液蛋白質(zhì)組表達(dá)譜變化的研究中，我們沒有發(fā)現(xiàn)明顯的所謂“有或無(wú)”(“presentorabsent

13、”)特點(diǎn)的蛋白質(zhì)峰存在。但是，在輕度與重度顱腦損傷比較中我們發(fā)現(xiàn)了10個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的蛋白質(zhì)峰：m/z位于8571、7612、13355、8605、4852、6685、2011、5408、8933、2415的蛋白質(zhì)峰。在重度顱腦損傷組中，有9個(gè)蛋白質(zhì)峰表達(dá)上調(diào)，這些蛋白質(zhì)譜的表達(dá)變化，可提示作為評(píng)價(jià)創(chuàng)傷程度的指標(biāo)。 3、2個(gè)m/z位于8571、5408的候選生物標(biāo)志物，在重度顱腦損傷與輕度顱腦損傷比較中建立的判別模型中，敏感性和

14、特異性分別為100％和100％，顯示了良好的判別能力，為顱腦損傷的評(píng)估提示了新的方法。 4、對(duì)重度顱腦損傷傷后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的腦脊液蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)M/Z位于8605的蛋白質(zhì)在傷后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)均可檢測(cè)到，顯示連續(xù)存在的趨勢(shì)。且在自身比較中，表達(dá)均呈現(xiàn)為明顯的逐漸下降趨勢(shì)。表明重度顱腦損傷后部分差異蛋白質(zhì)有時(shí)序性變化。 5、在不同程度的顱腦損傷后、在顱腦損傷后的不同時(shí)間，神經(jīng)系統(tǒng)中