中藥逆轉(zhuǎn)大腸埃希菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:研究三黃湯，黃連解毒湯和五味消毒飲三種中藥方劑對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌部分或全部恢復(fù)對(duì)抗生素敏感性的作用，考察三種復(fù)方中藥產(chǎn)生最大逆轉(zhuǎn)效果的最佳時(shí)間及濃度。并通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定經(jīng)三味復(fù)方中藥培養(yǎng)的耐藥性大腸埃希菌其超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的活性及表達(dá)以進(jìn)一步探討三者對(duì)耐藥性大腸埃希菌存在的逆轉(zhuǎn)機(jī)制。 方法:用紙片擴(kuò)散法和雙紙片協(xié)同法篩選產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌，用試管二倍稀釋法確定三黃湯、黃連解毒湯和五味消毒飲三種復(fù)方中

2、藥的最低抑菌濃度，選取低于最低抑菌濃度的不同濃度在不同時(shí)間下培養(yǎng)耐藥性大腸埃希菌，比較各中藥不同濃度、不同時(shí)間的逆轉(zhuǎn)效果，選取最佳逆轉(zhuǎn)效果的培養(yǎng)時(shí)間和藥物濃度，并將在此條件培養(yǎng)的耐藥性大腸埃希菌提取超廣譜β-內(nèi)酰胺酶測(cè)定其逆轉(zhuǎn)前后的活性和含量，探索其逆轉(zhuǎn)機(jī)理。 結(jié)果:從蘭州市一所省級(jí)醫(yī)院提取采集耐藥性大腸埃希菌，用紙片擴(kuò)散法和雙紙片協(xié)同法篩選產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。測(cè)定三種復(fù)方中藥對(duì)標(biāo)準(zhǔn)株大腸埃希菌ATCC2

3、5922的最低抑菌濃度(MIC)，分別為MIC(三黃湯)為0.5g/ml；MIC(黃連解毒湯)為0.6g/ml；MIC(五味消毒飲)為0.7g/ml。測(cè)定產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌經(jīng)克拉維酸培養(yǎng)，其藥敏直徑恢復(fù)到敏感程度的最低濃度為克拉維酸的最低逆轉(zhuǎn)濃度。結(jié)果表明，克拉維酸使產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌恢復(fù)其對(duì)抗生素敏感性的最低濃度為15μg/ml，將此濃度下培養(yǎng)的大腸埃希菌作為陽(yáng)性對(duì)照。用三種中藥方劑在低于最低抑菌濃度的不同濃度及時(shí)間條

4、件下培養(yǎng)耐藥性大腸埃希菌，記錄各抑菌圈直徑，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5析因分析方法處理數(shù)據(jù)，三黃湯在0.2g/ml 24h，黃連解毒湯在0.4g/ml 12h，五味消毒飲在0.3g/ml36h和0.4g/ml 48h的逆轉(zhuǎn)效果最佳，但與陽(yáng)性對(duì)照克拉維酸比較有顯著性差異(P<0.05)。同時(shí)提取超廣譜β-內(nèi)酰胺酶做三維實(shí)驗(yàn)，證明超聲破碎法優(yōu)于反復(fù)凍融法，以底物頭孢噻肟與提取的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)反應(yīng)測(cè)定OD值，根據(jù)公式計(jì)算酶活

5、，中藥方劑能夠抑制酶活性從而降低耐藥性，與克拉維酸陽(yáng)性對(duì)照逆轉(zhuǎn)效果的比較未有顯著性差異(P>0.05)，與未經(jīng)任何實(shí)驗(yàn)因素作用的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌陰性對(duì)照比較有顯著性差異(P<0.05)。中藥方劑之間抑制酶活效果比較未見(jiàn)顯著差異(P>0.05)。比較三黃湯各拆方之間的抑酶效果，各拆方藥液能夠抑制酶活性，但與克拉維酸陽(yáng)性對(duì)照比較有顯著性差異(P<0.05)，同時(shí)與未經(jīng)逆轉(zhuǎn)作用的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌陰性對(duì)照比較也有顯著性差異(P<0.

6、05)。各拆方之間抑制酶活效果比較未見(jiàn)顯著差異(P>0.05)。將稀釋后的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算樣品中ESBLs含量。中藥方劑能夠抑制ESBLs的表達(dá)，但不及克拉維酸的抑制效果(P<0.05)，而與未經(jīng)任何實(shí)驗(yàn)因素作用的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌陰性對(duì)照比較有顯著性差異(P<0.05)。中藥各拆方也能夠抑制ESBLs的表達(dá)，效果與克拉維酸作用未見(jiàn)顯著性差異(P>0.05)，同時(shí)與未經(jīng)任何實(shí)驗(yàn)因素作用的產(chǎn)ESBLs大腸

7、埃希菌陰性對(duì)照比較有顯著性差異(P<0.05)。 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，三黃湯、黃連解毒湯和五味消毒飲三種清熱解毒方劑在逆轉(zhuǎn)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥性方面有確切作用，且逆轉(zhuǎn)作用與中藥濃度及培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)。三者比較，三黃湯是逆轉(zhuǎn)效果最大的中藥方劑。通過(guò)對(duì)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶活性及表達(dá)含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，抑制超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的活性和表達(dá)是中藥逆轉(zhuǎn)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥性的主要途徑之一，但并不排除其他逆轉(zhuǎn)機(jī)制的存在，還需進(jìn)一步探討。