過表達ZmPP2AA1基因和ZmNF-YA1基因?qū)τ衩字仓昕鼓嫘缘挠绊?pdf

1、植物作為固著生物，其生長發(fā)育受到干旱、高鹽、冷/熱脅迫和營養(yǎng)元素缺乏等非生物逆境脅迫的嚴(yán)峻考驗。植物感受逆境脅迫信號后，通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對不利于自身生長的環(huán)境因素做出相應(yīng)的應(yīng)答和抵御。其中，激酶/蛋白磷酸酶介導(dǎo)的磷酸化/去磷酸化和轉(zhuǎn)錄因子是響應(yīng)逆境脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)機制。本研究分析了玉米中兩個應(yīng)答非生物脅迫基因的分子特征以及它們在玉米抵御逆境環(huán)境時的作用。包括一個響應(yīng)低磷脅迫的蛋白磷酸酶2A的A亞基基因ZmPP2AA1，和一個響

2、應(yīng)干旱、高鹽脅迫及離子毒害的轉(zhuǎn)錄因子NF-YA基因ZmNF-YA1。過表達ZmPP2AA1提高了玉米低磷耐受性
　　玉米是重要的糧飼作物兼工業(yè)原料，在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟中占有重要地位。土壤中的磷儲存很多，但是由于磷對土壤中的金屬離子親和力高，易形成復(fù)合物，因此植物可吸收利用的無機磷嚴(yán)重不足。向農(nóng)田中施入大量的可溶性磷肥可使作物增產(chǎn)，但該措施不僅加大成本而且污染環(huán)境。因此，了解植物適應(yīng)低磷環(huán)境的機制，利用并改良作物自身固有的高效利用土壤磷素的

3、生物學(xué)特性，開發(fā)高效利用磷營養(yǎng)新品種，對于農(nóng)業(yè)、經(jīng)濟及環(huán)境具有深遠意義。
　　根系是吸收磷素的主要器官，已有多項成功案例關(guān)于通過改良植物根系構(gòu)型獲得低磷耐受性的植物。本實驗室對低磷培養(yǎng)的玉米根進行轉(zhuǎn)錄組及磷酸蛋白組分析中發(fā)現(xiàn)，有2個PP2A的亞基基因受低磷誘導(dǎo)表達，一個催化亞基的蛋白豐度在低磷脅迫時發(fā)生動態(tài)變化，推測它們的表達水平變化可能與低磷信號傳導(dǎo)相關(guān)。本工作中，發(fā)現(xiàn)玉米根中ZmPP2AA1的轉(zhuǎn)錄受低磷脅迫后上調(diào)表達。為了明確

4、ZmPP2AA1在玉米低磷耐受性中的作用，通過基因工程手段在玉米骨干自交系Qi-319中過表達ZmPP2AA1和通過RNAi干擾方法降低ZmPP2AA1的表達水平，比較不同轉(zhuǎn)基因純合系植株在足磷/氐磷條件下的形態(tài)差異和生理生化的變化，進而探究ZmPP2AA1在調(diào)節(jié)玉米生長發(fā)育和低磷耐受性中的生物學(xué)功能及其作用機制。
　　觀察足磷水培條件下的ZmPP2AA1轉(zhuǎn)基因玉米和野生型對照自交系Qi-319(WT)的表型，發(fā)現(xiàn)過表達株系的初生

5、根發(fā)生卷曲、軸生根的伸長受到抑制，而RNAi株系的初生根垂直生長、軸生根的伸長受到促進。ZmPP2AA1過表達株系的側(cè)根密度和側(cè)根長度顯著高于WT的，ZmPP2AA1RNAi株系則表現(xiàn)出相反的趨勢。這些結(jié)果表明，ZmPP2AA1調(diào)節(jié)玉米初生根的向重性及生長，且正向調(diào)控側(cè)根的形成和伸長。
　　根系構(gòu)型的改變是響應(yīng)低磷環(huán)境的典型表型。玉米ZmPP2AA1過表達、RNAi植株和WT在足磷(SP)或低磷(LP)條件下水培15天后，比較分析

6、各基因型植株的根系形態(tài)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)在低磷條件下過表達ZmPP2AA1增加了玉米軸生根數(shù)目，刺激了側(cè)根的產(chǎn)生，形成了一個更為發(fā)達的根系，顯著增大了活性吸收面積。而ZmPP2AA1RNAi株系中軸生根的數(shù)目與野生型的無差異、但長度增加，側(cè)根密度降低，活性吸收面積減小。因此，玉米體內(nèi)ZmPP2AA1基因表達水平的變化可影響低磷脅迫介導(dǎo)的根系構(gòu)型變化。
　　在遭受低磷脅迫時，過表達ZmPP2AA1植株延遲和減少了花青素的積累，積累了較多的干

7、物質(zhì)。而ZmPP2AA1RNAi株系無論在足磷還是低磷環(huán)境下，其地上、地下部分的干重都顯著低于WT的。低磷環(huán)境下ZmPP2AA1過表達植株積累了更多的磷素，而RNAi株系的磷積累顯著低于WT的。這與它們的磷吸收能力成正比。無論在SP或LP條件下，過表達株系具有更高的Imax值;在低磷脅迫時，其Km值和Cmin值顯著低于WT的;而ZmPP2AA1RNAi的Km值和Cmin值顯著高于WT的。即在遭遇低磷環(huán)境時，過表達ZmPP2AA1玉米植株

8、的根系對磷的親和力更高，吸收磷的能力更強。過表達植株體內(nèi)積累較多的磷可緩解低磷脅迫對其生長的抑制作用，因此表現(xiàn)出較好的低磷耐受性。在遭受長期磷缺乏時，過表達ZmPP2AA1植株的生殖器官發(fā)育較好，籽粒產(chǎn)量較高。在玉米中過表達ZmPP2AA1可顯著提高植株對低磷脅迫的耐受性。
　　ZmPP2AA1可能通過影響根系生長素的含量和分布調(diào)節(jié)玉米低磷耐受性
　　生長素是一類參與調(diào)控植物多項生長發(fā)育的植物激素，且對低磷誘導(dǎo)的根系構(gòu)型變化

9、起重要調(diào)節(jié)作用。ZmPP2AA1過表達玉米植株軸生根頂端的生長素含量顯著高于WT和ZmPP2AA1RNAi的，暗示ZmPP2AA1過表達植株軸生根卷曲且伸長受抑制可能與根中生長素水平及分布的改變相關(guān)聯(lián)。此外，過表達ZmPP2AA1轉(zhuǎn)基因植株對生長素運輸抑制劑NPA反應(yīng)更強烈，提示轉(zhuǎn)ZmPP2AA1基因玉米改變了生長素運輸影響玉米根尖生長素的積累，從而影響根系的生長發(fā)育及根系構(gòu)型。
　　磷缺乏環(huán)境下過表達ZmPP2AA1玉米可維持較

10、好的莖葉生長，形成一個高度分枝的發(fā)達根系，增強對磷的吸收，其耐低磷特性顯著提高。在長期低磷脅迫時，過表達ZmPP2AA1玉米植株因積累更多的磷素，生殖發(fā)育受影響較小，產(chǎn)量顯著高于野生型玉米。
　　ZmNF-YA1參與玉米植株生長發(fā)育和抗逆性調(diào)控
　　培育對不利環(huán)境具有較強抗性的作物品種對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有重要意義。NF-Y轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要生物學(xué)功能。課題組在玉米比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)NF-Y轉(zhuǎn)錄因

11、子家族成員ZmNF-YA1基因在抗旱自交系中響應(yīng)干旱脅迫上調(diào)表達。本工作分析了ZmNF-YA1在玉米不同發(fā)育時期的不同器官和幾種非生物逆境脅迫下的表達模式。利用Zm NF-YA1過表達和Mu轉(zhuǎn)座子插入突變體為材料研究該基因?qū)τ谟衩咨L發(fā)育和抗逆性的影響。
　　ZmNF-YA1在玉米植株中廣譜表達，在葉片、授粉后籽粒和花藥中具有較高的表達水平，暗示ZmNF-YA1可能調(diào)控這些器官的生長發(fā)育。玉米在遭受滲透脅迫、鹽脅迫和熱脅迫2小時后

12、，葉片中的ZmNF-YA1的表達強度升高，且以上三種脅迫連續(xù)處理3天后，還能保持比未處理對照更高的表達量，即Zm NF-YA1應(yīng)答和響應(yīng)上述非生物逆境脅迫。
　　觀察溶液培養(yǎng)的ZmNF-YA1過表達、Mu轉(zhuǎn)座子插入突變體和它們相對應(yīng)的野生型自交系DH4866、W22的植株表型。在發(fā)育早期，ZmNF-YA1過表達植株的軸生根較野生型的短，而地上部分與野生型無明顯差異。由于ZmNF-YA1過表達株系具有更快的生長速率，植株高度逐漸高于

13、野生型的，地上部干重也相應(yīng)增加，根系發(fā)達，側(cè)根數(shù)目多。Mu轉(zhuǎn)座子插入缺失突變體的生長發(fā)育滯后，其株高、葉片長寬及面積均顯著低于野生型對照W22的，根系也不如W22的發(fā)達。這些結(jié)果表明ZmNF-YA1正向調(diào)節(jié)玉米植株莖葉及根系的生長發(fā)育。
　　對三葉期玉米進行滲透脅迫、鹽脅迫和離子毒害處理,過表達ZmNF-YA1轉(zhuǎn)基因株系中干物質(zhì)積累和株高受脅迫抑制的程度較野生型輕，而突變體對上述三種脅迫的響應(yīng)比其對照株系更為強烈，受害程度重，表明

14、玉米ZmNF-YA1基因表達水平的變化可影響植株對滲透脅迫、鹽脅迫和離子毒害的耐受性，ZmNF-YA1參與玉米植株對逆境脅迫的響應(yīng)。
　　過表達ZmNF-YA1提高了玉米的抗旱性
　　對五葉期植株進行干旱致死處理后再恢復(fù)正常澆水，過表達ZmNF-YA1植株大部分能恢復(fù)生長，但其野生型對照DH4866只有少數(shù)植株能恢復(fù)生長，Mu轉(zhuǎn)座子插入突變體植株幾乎全部死亡。過表達ZmNF-YA1可明顯提高苗期玉米植株對干旱的耐受性。

15、>　　對開花前的盆栽植株進行干旱處理，過表達ZmNF-YA1植株生長狀態(tài)好于其野生型對照，根系更為發(fā)達，葉片細胞膜受損傷程度較輕。與此相對的是過表達株系葉片積累了更多滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，維持較高的相對含水量，具有顯著升高的抗氧化保護酶活性，從而提高細胞對活性氧等自由基的清除，減少細胞損傷，維持正常功能。因此，與野生型相比，過表達ZmNF-YA1有效地提高了玉米的耐旱性。
　　在實驗室王保梅的工作中，過表達ZmNF-YB16促進玉米苗期植

16、株生長，干旱脅迫誘導(dǎo)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)增多、抗氧化酶的活性增強，過表達ZmNF-YB16植株表現(xiàn)出明顯提高的耐旱性。這些表型與過表達ZmNF-YA1玉米植株相似。利用酵母雙雜系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)ZmNF-YA1可與ZmNF-YC17結(jié)合，ZmNF-YB16可與ZmNF-YC17結(jié)合。本研究中，利用免疫共沉淀驗證了ZmNF-YA1與ZmNF-YC17在玉米體內(nèi)的互作，推測ZmNF-YA1可能與ZmNF-YB16/-YC17形成復(fù)合體起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，它們共同