富油底棲硅藻的篩選和培養(yǎng)條件的優(yōu)化.pdf

1、本文以掛板法采集溫州市洞頭海區(qū)野生底棲硅藻，分離出16株底棲硅藻，經(jīng)培養(yǎng)后對(duì)藻細(xì)胞進(jìn)行尼羅紅染色觀察，初步篩選出9株油球較大的藻株，然后進(jìn)一步開展培養(yǎng)和油脂測(cè)定實(shí)驗(yàn)，最終篩選出兩株生長(zhǎng)較快、含油量較高的底棲硅藻——咖啡雙眉藻Amphora coffeaeformis和縊縮菱形藻Nitzschia constricta。以該兩株底棲硅藻為對(duì)象，探討了尼羅紅染色法檢測(cè)硅藻油脂相對(duì)含量的最優(yōu)條件和氮、磷、硅、植物激素吲哚乙酸IAA和脫落酸AB

2、A、固定化對(duì)其繁殖生長(zhǎng)和油脂積累的影響。主要研究結(jié)果如下：
　　1.富油底棲硅藻的分離純化和篩選
　　采用掛板法獲得野生底棲硅藻，平板分離法和水滴分離法相結(jié)合分離純化得16株底棲硅藻，其中菱形藻屬5種、雙眉藻屬3種、舟形藻屬3種、羽紋藻屬2種、曲殼藻屬2種、擬菱形藻屬1種。硅藻細(xì)胞經(jīng)尼羅紅染色熒光顯微鏡觀察，初步篩選得9種油體占藻細(xì)胞體積較大的藻株，其中菱形藻屬3種、雙眉藻屬3種、舟形藻屬2種、羽紋藻屬1種。根據(jù)9株微藻的比

3、平均生長(zhǎng)速率和總脂含量的乘積，最終篩選出2株生長(zhǎng)快、含油量高的底棲硅藻——咖啡雙眉藻 Amphora coffeaeformis和縊縮菱形藻Nitzschia constricta作為實(shí)驗(yàn)藻株。
　　2.硅藻細(xì)胞尼羅紅染色的條件優(yōu)化
　　尼羅紅（Nile Red）是一種脂溶性的熒光染料，細(xì)胞經(jīng)尼羅紅染色后，在熒光顯微鏡下可觀察到金黃色熒光。尼羅紅染色熒光檢測(cè)微藻中油脂的相對(duì)含量的方法，其最佳條件因儀器和藻種差異會(huì)有所不同，選

4、擇合適的染色條件對(duì)更準(zhǔn)確快捷測(cè)定微藻油脂相對(duì)含量十分重要。為優(yōu)化兩株藻株的尼羅紅熒光光譜法測(cè)定油脂含量的最適條件，本試驗(yàn)通過對(duì)兩種藻株中性脂發(fā)射峰、尼羅紅濃度、染色時(shí)間、細(xì)胞密度的探索，得出了本實(shí)驗(yàn)對(duì)象兩株藻株的尼羅紅熒光光譜法測(cè)定油脂的最適條件為：中性脂發(fā)射峰575nm、尼羅紅濃度1μg/ml、染色時(shí)間6min、細(xì)胞密度OD680＜0.5。
　　3.氮、磷、硅對(duì)兩株底棲硅藻繁殖生長(zhǎng)及油脂含量的影響
　　采用光密度法和尼羅紅

5、染色法分別測(cè)定了氮、磷、硅對(duì)底棲硅藻咖啡雙眉藻Amphora coffeaeformis和縊縮菱形藻Nitzschia constricta的繁殖速度和油脂積累的影響。結(jié)果顯示：2種底棲藻在NO3-N濃度為1.746 mg/L時(shí)，細(xì)胞均無明顯繁殖生長(zhǎng)，且在實(shí)驗(yàn)第7天開始死亡，當(dāng) NO3-N濃度繼續(xù)升高后，細(xì)胞繁殖速度開始加快，當(dāng)NO3-N濃度達(dá)8.820 mg/L后，硅藻細(xì)胞的繁殖速度不再明顯加快。
　　在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的濃度范圍內(nèi)，2

6、種硅藻的繁殖速度均隨H2PO4-P濃度升高而加快，但當(dāng)H2PO4-P濃度達(dá)到0.884 mg/L后，硅藻細(xì)胞的繁殖速度不再明顯加快；
　　在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的濃度范圍內(nèi)，2種底棲硅藻均隨SiO3-Si濃度增加而加快，但SiO3-Si濃度對(duì)2種底棲硅藻細(xì)胞繁殖速度影響并不顯著。
　　3種元素對(duì)2種底棲硅藻繁殖速度的影響力：N＞P＞Si。實(shí)驗(yàn)期間，2種底棲硅藻的油脂含量均呈先降后升的變化規(guī)律，油脂的積累主要集中在實(shí)驗(yàn)后期，氮磷硅限制均能

7、促進(jìn)2種底棲硅藻細(xì)胞油脂的積累，對(duì)2株底棲硅藻細(xì)胞油脂積累的影響程度，氮限制比磷和硅限制都要大。
　　4.植物激素IAA和ABA對(duì)兩株底棲硅藻生長(zhǎng)及油脂含量的影響
　　為探索植物生長(zhǎng)激素對(duì)底棲硅藻繁殖生長(zhǎng)和油脂積累的影響，作者以咖啡雙眉藻和縊縮菱形藻為材料設(shè)計(jì)了不同濃度 IAA和ABA對(duì)兩種底棲硅藻繁殖生長(zhǎng)和油脂積累影響的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：低濃度的IAA和ABA能夠明顯促進(jìn)兩株藻的生長(zhǎng)，高濃度則會(huì)抑制生長(zhǎng)，兩株微藻最適宜I

8、AA和ABA濃度有所不同：低濃度的IAA對(duì)兩株底棲硅藻的生長(zhǎng)能起到明顯的促進(jìn)作用，0.5mg/L時(shí)效果最為明顯；IAA濃度為2 mg/L組的細(xì)胞密度反而低于對(duì)照組的細(xì)胞密度；在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期向培養(yǎng)基中添加低濃度（0-1.0 mg/L）的ABA能夠有效促進(jìn)兩株底棲硅藻的生長(zhǎng)，而高濃度（＞1.0 mg/L）的ABA則抑制了2株底棲硅藻細(xì)胞的繁殖生長(zhǎng)。向培養(yǎng)基中添加適量的IAA（濃度為0.5 mg/L）能顯著促進(jìn)兩株微藻的油脂積累；ABA在低濃度

9、（＜1.0mg/L）能顯著促進(jìn)兩株微藻油脂的積累。
　　5.固定化對(duì)兩株底棲硅藻繁殖生長(zhǎng)及油脂含量的影響
　　為探討固定化培養(yǎng)對(duì)底棲硅藻繁殖生長(zhǎng)和油脂積累的影響，對(duì)篩選出的兩種富油底棲硅藻進(jìn)行了固定化培養(yǎng)試驗(yàn)。結(jié)果表明：咖啡雙眉藻固定化對(duì)繁殖生長(zhǎng)影響不大，固定化組與空白對(duì)照組硅藻的繁殖生長(zhǎng)情況基本上無差異，最終細(xì)胞密度無顯著差異。與咖啡雙眉藻不同，縊縮菱形藻固定化后，初期有一個(gè)延緩期，然后加快，且到第19d仍保持較快的生長(zhǎng)速