腺病毒纖突結(jié)的改造及改造后的特性研究.pdf

1、目的：復(fù)制缺陷型腺病毒載體(replication deficient first generationadenovirus vector,FGAd)因其安全性好、轉(zhuǎn)基因表達效率高和感染宿主細胞范圍廣等特點,目前正廣泛應(yīng)用于基因治療。但是部分細胞特別是樹突狀細胞(Dendritical cells,DCs)和腫瘤細胞等低表達甚至不表達腺病毒受體(coxsackie-adnovirus receptor,CAR),限制了FGAd作為基因治

2、療載體的廣泛應(yīng)用。有研究表明,在腺病毒纖突結(jié)(fiber knob)的HI loop插入一段精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspartate,RGD)肽,可提高FGAd對腫瘤細胞的感染效率。然而目前已有的改造方法,多涉及對大質(zhì)粒的多步酶切,連接,操作繁瑣。RD細胞和T24細胞是CAR低表達的腫瘤細胞,普通的FGAd很難取得理想的感染效果,因此在已有方法的基礎(chǔ)上進行改進,建立一種更簡單可行的方法在FGAd纖突

3、結(jié)的HI loop插入RGD,通過該方法構(gòu)建表達增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的FGAd-RGD-EGFP,與表達綠色熒光蛋白的FGAd-EGFP在RD和T24細胞中進行體外感染和轉(zhuǎn)基因表達效率的比較研究。通過該方法構(gòu)建表達人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial viruse,RSV)密碼子優(yōu)化型融合蛋白(codon optimize

4、d fusion glycoprotein,Fsyn)的FGAd-RGD-Fsyn,與僅表達Fsyn的FGAd-Fsyn分別免疫小鼠,進行體內(nèi)免疫反應(yīng)的比較研究,為改造后的載體在腫瘤等疾病治療上的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：用EcoRⅠ酶切pAdEasy–1質(zhì)粒,產(chǎn)生約9kb的小片段和23kb的大片段,之后把小片段自連,獲得質(zhì)粒pY,用PCR的方法在pY中插入RGD,之后再將小片段和大片段連接,獲得插入RGD的pAdeasy-RGD

5、-1質(zhì)粒。pShuttle-CMV-EGFP和pShuttle-CMV-Fsyn經(jīng)PmeⅠ線性化后,與pAdEasy-RGD-1在BJ5183感受態(tài)細胞中同源重組,重組成功后的pAd-RGD-EGFP和pAd-RGD-Fsyn經(jīng)PacⅠ酶切回收后轉(zhuǎn)染HEK293細胞,包裝獲得重組腺病毒FGAd-RGD-EGFP和FGAd-RGD-Fsyn。經(jīng)CsCl超速離心純化重組腺病毒,以1000病毒顆粒(viral particle number,

6、vp)/cell的感染量,用FGAd-EGFP和FGAd-RGD-EGFP分別感染RD和T24細胞,感染后48h,用流式細胞儀檢測EGFP的表達情況。同時,分別用1×108vp的FGAd-Fsyn和FGAd-RGD-Fsyn免疫小鼠,檢測抗體反應(yīng)情況。
　　結(jié)果：通過該方法成功構(gòu)建了可表達EGFP的FGAd-RGD-EGFP和可表達Fsyn的FGAd-RGD-Fsyn。與FGAd-EGFP相比,FGAd-RGD-EGFP對RD和T