食管癌細(xì)胞中NGAL蛋白受體的研究.pdf

1、新近有研究證明,NGAL是一種新型轉(zhuǎn)鐵蛋白,經(jīng)特異受體,介導(dǎo)著一條獨(dú)特跨膜轉(zhuǎn)鐵通路。我們以往研究發(fā)現(xiàn),NGAL在人食管上皮癌變中顯著過表達(dá),與癌細(xì)胞侵襲性和不良分化密切相關(guān),但作用機(jī)制不甚明了。最近我們的研究表明,NGAL蛋白跨膜轉(zhuǎn)鐵通路可能存在于慢性炎癥食管上皮和食管癌組織中,可被炎癥因子誘導(dǎo)激活。推測借此會有過量鐵離子涌入細(xì)胞,引發(fā)嚴(yán)重自由基反應(yīng)與基因突變,誘導(dǎo)癌變,加劇癌細(xì)胞多樣性生存競爭,進(jìn)而演變出侵襲性更強(qiáng)癌細(xì)胞克隆。為了探討

2、NGAL蛋白在食管癌中的具體作用機(jī)制,我們分析了食管癌細(xì)胞中NGAL蛋白受體的表達(dá)并發(fā)現(xiàn)了一種新的NGAL蛋白受體剪接亞型NgalR-3。實驗結(jié)果表明,在COS-7細(xì)胞異源表達(dá)系統(tǒng)中,NgalR-3蛋白與NGAL蛋白顯示出相同的細(xì)胞定位模式;而免疫共沉淀實驗證實,兩蛋白間存在著明確的相互作用關(guān)系。這些研究提示,NgalR-3可能是NGAL蛋白的一個潛在受體,在介導(dǎo)食管癌細(xì)胞NGAL蛋白跨膜轉(zhuǎn)鐵中發(fā)揮作用。
　　內(nèi)容與方法:

3、　　1.通過RT-PCR技術(shù)檢測NGAL基因及其受體NgalR-1/2在多個食管癌細(xì)胞系、食管癌組織和食管癌手術(shù)切緣組織中的表達(dá)情況。
　　2.從EC18食管癌細(xì)胞中克隆NgalR基因,分析cDNA的結(jié)構(gòu)特征。
　　3.通過RT-PCR技術(shù)檢測新發(fā)現(xiàn)的NGAL受體選擇性剪接亞型NgalR-3在多個食管癌細(xì)胞系、食管癌組織、食管癌手術(shù)切緣組織以及其他正常組織中的表達(dá)情況。
　　4.Western Blotting分析CO

4、S-7細(xì)胞中異源轉(zhuǎn)染的NgalR-2與NgalR-3等選擇性剪接亞型的表達(dá)情況,同時應(yīng)用哺乳動物細(xì)胞免疫共沉淀技術(shù)和免疫熒光細(xì)胞分析技術(shù),檢測NGAL蛋白與其受體NgalR-2或NgalR-3在細(xì)胞內(nèi)的相互作用及其細(xì)胞共定位情況。
　　5.構(gòu)建NgalR-2和NgalR-3哺乳動物細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)載體,篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。
　　結(jié)果和結(jié)論:
　　1.RT-PCR檢測結(jié)果顯示,食管癌細(xì)胞系EC171、EC18、EC109、E

5、C8712,以及食管癌組織和食管癌手術(shù)切緣組織中均有NGAL及其膜受體(NgalR-1/2)的表達(dá)。提示NGAL跨膜轉(zhuǎn)鐵通路可能存在于食管癌組織細(xì)胞中。
　　2.對EC18食管癌細(xì)胞中NGAL受體(NgalR)的cDNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)存在多個選擇性剪接亞型。序列比對結(jié)果顯示,在EC18食管癌細(xì)胞中NgalR基因mRNA除文獻(xiàn)報道的NgalR-1和NgalR-2選擇性剪接亞型(分別編碼538個和520個氨基酸)外,還存在另外兩個

6、新的mRNA選擇性剪接亞型NgalR-3和NgalR-4,分別編碼207和88個氨基酸殘基。
　　3.RT-PCR檢測結(jié)果顯示,NgalR-3在多個食管癌細(xì)胞系、食管癌組織、食管癌手術(shù)切緣組織以及正常組織中均有表達(dá)。20例食管癌與切緣配對組織樣本,在食管癌組織中,有14例樣本NgalR-3mRNA表達(dá)水平上調(diào),占70％;11例樣本NgalR-1/2mRNA表達(dá)水平上調(diào),占55%,提示NgalR-3在食管癌中所發(fā)揮作用可能更加重要。

7、
　　4.異源細(xì)胞表達(dá)檢測證實,NgalR-2或NgalR-3蛋白分子量的大小與預(yù)測結(jié)果一致。免疫熒光細(xì)胞分析技術(shù)證實,NgalR-3蛋白與NGAL蛋白顯示出相同的細(xì)胞定位模式。而免疫共沉淀實驗證實,NgalR-3蛋白與NGAL蛋白間存在著相互作用。提示NgalR-3蛋白可能是NGAL蛋白的一個潛在的受體,在食管癌細(xì)胞NGAL蛋白跨膜轉(zhuǎn)鐵中發(fā)揮作用。
　　5.構(gòu)建了NGAL蛋白受體基因真核表達(dá)載體pcDNA-myc-Ngal