PEDF基因修飾色素上皮細(xì)胞對(duì)脈絡(luò)膜新生血管作用的體外研究.pdf

1、目的：分離、培養(yǎng)和純化原代視網(wǎng)膜(RPE)和虹膜色素上皮細(xì)胞(IPE)，比較RPE與IPE的生物學(xué)特性。分離和培養(yǎng)原代脈絡(luò)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(CEC)，建立脈絡(luò)膜新生血管體外模型。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)的方法研究色素上皮源性因子(PEDF)及PEDF基因修飾的色素上皮細(xì)胞對(duì)脈絡(luò)膜新生血管的作用。材料和方法：采用酶輔助顯微分離牛眼RPE和IPE細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)，密度梯度離心法純化，免疫組化的方法進(jìn)行鑒定。觀察比較RPE、IPE細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)

2、狀況，RT-PCR方法檢測(cè)與RPE功能密切相關(guān)的幾種蛋白質(zhì)mRNA的表達(dá)。采用磁分選技術(shù)分離培養(yǎng)原代的脈絡(luò)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，用Ⅳ型膠原鋪板，誘導(dǎo)細(xì)胞分化、連接形成血管樣結(jié)構(gòu)。用脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染法將人PEDF基因?qū)塍w外培養(yǎng)的虹膜色素上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，利用質(zhì)粒包含的抗稻瘟菌素的耐藥性基因篩選穩(wěn)定表達(dá)PEDF的色素上皮細(xì)胞株。RT-PCR鑒定PEDF在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)；ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞分泌PEDF的水平。采用Culture

3、Insert共培養(yǎng)PEDF基因修飾的色素上皮細(xì)胞和CEC細(xì)胞，觀察PEDF對(duì)有或無(wú)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)刺激條件下CEC的增生、移行和血管樣結(jié)構(gòu)的形成的影響效應(yīng)；ELISA方法檢測(cè)共培養(yǎng)細(xì)胞上清液中VEGF濃度。結(jié)論：RPE、IPE細(xì)胞形態(tài)與體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性類似，IPE細(xì)胞能夠表達(dá)部分和RPE功能密切相關(guān)的蛋白。借助磁分選技術(shù)能夠分離出高純度的脈絡(luò)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，在類似細(xì)胞外基質(zhì)成分的環(huán)境下能夠分化形成血管樣結(jié)構(gòu)。PEDF