Ⅰ型維生素D依賴性佝僂病和家庭性腺瘤樣息肉病的致病基因突變分析.pdf

1、目的：
　　 Ⅰ型維生素D依賴性佝僂病(Vitamin D-dependent rickets typeⅠ，VDDRⅠ)是一種以低鈣血癥、尿磷增多、骨骼損害為特征的常染色體隱性遺傳病。該病是一種少有的非營(yíng)養(yǎng)性佝僂病，國(guó)內(nèi)罕見報(bào)道，目前尚無流行病學(xué)資料。該病主要是由于CYP27B1基因突變導(dǎo)致在腎小管上皮細(xì)胞中合成1，25(OH)2D3的25(OH)D3-1α羥化酶活性降低，生成1，25(OH)2D3減少所致。人類CYP27B1基

2、因定位于染色體12q13.1-13.3，全長(zhǎng)4859bp，包含9個(gè)外顯子，編碼25(OH)D3-1α羥化酶，到目前為止已經(jīng)確定了38個(gè)與Ⅰ型維生素D依賴性佝僂病相關(guān)的CYP27B1基因突變。本文通過對(duì)家系中一例Ⅰ型維生素D依賴性佝僂病患者進(jìn)行CYP27B1基因的突變分析檢測(cè)致病基因序列的改變，同時(shí)輔助臨床診斷和提供遺傳咨詢并有望豐富該基因的突變數(shù)據(jù)庫(kù)。
　　 家族性腺瘤性息肉病(Family adenomatous polypo

3、sis，F(xiàn)AP)是一種以多發(fā)性腺瘤樣息肉為主要特征的常染色體顯性遺傳病，發(fā)病率為1/17000至1/5000，癌變率很高。目前普遍認(rèn)為家族性腺瘤樣息肉病的發(fā)生與結(jié)腸腺瘤性息肉病基因APC(adenomatous polyposis coli)突變有著直接關(guān)系。研究證明APC基因是一種抑癌基因，定位于5q21-22，編碼區(qū)全長(zhǎng)8538bp，包含15個(gè)外顯子，其中第15外顯子全長(zhǎng)6577bp，是目前已知最大的人類外顯子。APC基因編碼APC

4、蛋白，包含2843個(gè)氨基酸，分子量約為310kD。APC基因的主要突變類型為點(diǎn)突變。大部分APC基因突變都會(huì)造成終止密碼子提前形成，導(dǎo)致蛋白截短，從而使其作為抑癌基因的作用喪失?，F(xiàn)在認(rèn)為，截短蛋白的形成與腺瘤的惡變有關(guān)，也有研究指出APC基因的雜合丟失與癌的形成有關(guān)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及對(duì)家族性腺瘤性息肉病的病因和APC基因逐步深入的了解，基因篩選診斷給我們提供了一種更先進(jìn)的診斷技術(shù)。
　　 材料與方法：
　　

5、一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 收集到Ⅰ型維生素D依賴性佝僂病家系共3人和兩個(gè)家族性腺瘤樣息肉病家系共8人，分別由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院和中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院提供外周血樣及相關(guān)病例資料。所有受檢成員以前均未接受過任何遺傳學(xué)檢測(cè)。
　　 二、方法
　　 （一）提取基因組DNA
　　 采用常規(guī)酚-氯仿方法或Universal Genomic DNA Extraction Kit(TaKaRa, Japan)提?、裥?/p>

6、維生素D依賴性佝僂病家系成員、家族性腺瘤樣息肉病家系成員及80名正常人對(duì)照外周血基因組DNA。
　　 （二）PCR-DNA測(cè)序和克隆測(cè)序檢測(cè)CYP27B1基因和APC基因突變
　　 針對(duì)CYP27B1基因和APC基因的外顯子及外顯子和內(nèi)含子交界處設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，擴(kuò)增CYP27B1基因和APC基因全部編碼序列。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA純化回收，采用Beckman CEQ-8000遺傳分析儀或ABI PRISM3700自動(dòng)測(cè)序儀

7、進(jìn)行測(cè)序分析，檢測(cè)是否存在基因編碼區(qū)突變。針對(duì)CYP27B1基因檢出的雜合突變利用克隆測(cè)序驗(yàn)證。
　　 （三）PCR-RFLP檢測(cè)
　　 針對(duì)測(cè)序檢測(cè)到的CYP27B1和APC基因序列改變，分別設(shè)計(jì)錯(cuò)配引物引入PvuⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)，選取80名正常對(duì)照個(gè)體，利用錯(cuò)配引物分別擴(kuò)增患者和正常對(duì)照個(gè)體的基因組DNA，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切和PAGE(Polyacrylamide gelelectrophoresis)檢測(cè)驗(yàn)證。<

8、br>　　 結(jié)果：
　　 一、Ⅰ型維生素D依賴性佝僂病患者CYP27B1基因突變分析結(jié)果
　　 PCR-DNA測(cè)序在Ⅰ型維生素D依賴性佝僂病患者CYP27B1基因中檢測(cè)到兩處雜合突變c.311-321delGGCCCGAGCGC(p.R104LfsX225)和c.473T＞C(p.L158P)，通過對(duì)其正常表型的父母相同位點(diǎn)測(cè)序證實(shí)為復(fù)合雜合突變，針對(duì)患者和正常人的PCR-RFLP(Restriction fragme

9、nt length polymorphism)檢測(cè)結(jié)果顯示80名正常對(duì)照個(gè)體未出現(xiàn)與患者相同位點(diǎn)的變異，排除了其為SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)位點(diǎn)的可能性。
　　 二、家族性腺瘤樣息肉病家系A(chǔ)PC基因突變分析結(jié)果
　　 APC基因直接測(cè)序分別在兩個(gè)家系中檢出雜合突變，c.1766T＞A(p.K589X)和c.3180-3184delAAAAC(p.110601fsX3)，突變位

10、點(diǎn)分別位于第14和第15外顯子，兩處突變均導(dǎo)致提前形成的終止密碼子。通過PCR-RFLP分析在80名正常對(duì)照個(gè)體中沒有發(fā)現(xiàn)相同位點(diǎn)的改變。
　　 結(jié)論：
　　 1、利用PCR-DNA測(cè)序檢測(cè)出Ⅰ型維生素D依賴性佝僂病患者CYP27B1基因兩處雜合突變c.311-321delGGCCCGAGCGC(p.R104LfsX225)和c.473T＞C(p.L158P)，經(jīng)PCR-RFLP驗(yàn)證和相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)證實(shí)為CYP27B1基