甲基乙二醛對培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：糖尿病是一種以血糖增高為特征的多病因的代謝性疾病。糖尿病腦病是糖尿病慢性并發(fā)癥之一,有學(xué)者稱之為“加速的腦老化”。近來研究發(fā)現(xiàn),糖尿病腦病的發(fā)生與氧化應(yīng)激和糖基化終產(chǎn)物有密切關(guān)系,糖尿病時由于高血糖促進(jìn)糖化反應(yīng),激活多元醇通路,使活性羰基化合物生成增加如甲基乙二醛、3-脫氧葡萄糖醛酮等,同時體內(nèi)代謝酶減少,尤其是氧化應(yīng)激狀態(tài)可導(dǎo)致大量活性羰基化合物蓄積,對組織細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)或毒性作用。N-乙酰半胱氨酸(NAC)是一含有巰基

2、的化合物,作為谷胱甘肽(GSH)的前體物質(zhì),在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為GSH,發(fā)揮對細(xì)胞的保護(hù)作用；NAC還是一種抗氧化劑,具有干擾自由基生成,清除己生成的自由基,調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝活性,預(yù)防DNA的損傷,調(diào)整基因的表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),以及抗細(xì)胞凋亡的作用。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)素家族主要成員之一。BDNF與其所支配神經(jīng)元軸突末梢上的特異性高親和力受體TrkB結(jié)合后,產(chǎn)生相應(yīng)分子對神經(jīng)元起保護(hù)、促進(jìn)再生作用,并與神經(jīng)元的生存、增殖分

3、化密切相關(guān),促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的形成。因此,探索活性羰基化合物MG對大鼠海馬神經(jīng)元的毒性作用及其對BDNF表達(dá)的影響以及抗氧化劑NAC對其保護(hù)作用,以進(jìn)一步探討糖尿病腦病的病因及尋找新的治療策略有重要的意義。目的：1.研究MG對培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)元存活率、凋亡率、活性氧(ROS)水平及BDNF表達(dá)的影響從而探討糖尿病腦病發(fā)生的可能機(jī)制；2.通過研究抗氧化劑NAC對MG培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)元存活率、凋亡率、ROS水平及BDNF表達(dá)的影響探

4、討其保護(hù)作用。 方法：取新生24h SD大鼠的海馬,原代培養(yǎng)其神經(jīng)元并予以鑒定,培養(yǎng)第七天給予藥物干預(yù),實(shí)驗(yàn)共分為5組：①對照組；②MG組；③NAC組；④MG和NAC同時處理組；⑤NAC預(yù)先處理組；MTT法檢測海馬神經(jīng)元存活率,AnnexinV-FITC聯(lián)合PI法檢測海馬神經(jīng)元的凋亡率及壞死率,以氧化敏感的2-7-二氫二氯熒光素(DCFH-DA)染色,熒光顯微鏡觀察并流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平,Real-time RT-P

5、CR及Western blot分別檢測BDNF mRNA及蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：1.MTT結(jié)果：隨著MG濃度的增加(0、10、50、100、200、400μM)及干預(yù)時間的延長(0h、2h、6h、12h、24h、36h、48h),海馬神經(jīng)元存活率逐漸降低,100μM MG干預(yù)24h海馬神經(jīng)元存活率為58±5.3％,其中MG干預(yù)24h的半數(shù)中毒濃度為145.6μM,故選擇100μM MG干預(yù)24h(MG組)用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)；不同濃

6、度的NAC(0、1、10、20、30、40、50mM)干預(yù)24h的海馬神經(jīng)元存活率也不相同,其中10mMNAC干預(yù)24h海馬神經(jīng)元存活率最高,因此選擇10mM NAC干預(yù)24h濃度(NAC組)用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。2.與對照組相比,MG組海馬神經(jīng)元的凋亡率明顯增加(P<0.01),MG和NAC同時處理組海馬神經(jīng)元的凋亡率較MG組明顯降低(P<0.01)。3.與對照組相比,MG組海馬神經(jīng)元的ROS水平明顯增加(P<0.01),NAC組海馬神經(jīng)元

7、的ROS水平明顯降低(P<0.01);與MG組相比,MG和NAC同時處理組及NAC預(yù)先處理組海馬神經(jīng)元的ROS水平明顯降低(P<0.01);4.與對照組相比,MG紐海馬神經(jīng)元BDNF mRNA及蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05),NAC組海馬神經(jīng)元BDNF mRNA及蛋白表達(dá)無明顯改變(P>0.05);與MG組相比,MG和NAC同時處理組、NAC預(yù)先處理組海馬神經(jīng)元BDNF mRNA及蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.01)。 結(jié)論：