分泌組學(xué)研究方法的優(yōu)化及其在癌癥研究中的應(yīng)用.pdf

1、癌癥嚴(yán)重威脅著人們的生命健康。對(duì)于癌癥患者而言，能否在癌癥早期得到診斷、癌癥是否轉(zhuǎn)移、治療是否有效是影響其治療效果和生存率的重要因素。分泌蛋白在癌癥的早期階段、轉(zhuǎn)移和治療耐受中都發(fā)揮著極為重要的作用。開展相關(guān)的癌癥分泌組學(xué)研究，系統(tǒng)篩查相關(guān)的分泌蛋白，有利于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)以及新型血清生物標(biāo)志物。本論文建立和優(yōu)化了系列分泌組學(xué)的研究方法，并緊緊圍繞上述影響癌癥患者治療效果和生存率的重要因素，開展了相關(guān)的分泌組學(xué)研究。
　　首先，本

2、論文優(yōu)化了基于細(xì)胞培養(yǎng)的分泌組學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)方法，建立了對(duì)分泌蛋白質(zhì)組進(jìn)行高效鑒定的一維凝膠電泳與液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合的技術(shù)路線(GeLC-MS/MS)，并將該技術(shù)應(yīng)用于鑒定和分析人乳腺癌MCF-7細(xì)胞及其多柔比星耐受細(xì)胞MCF-7/Dox的差異分泌蛋白質(zhì)組，以系統(tǒng)篩查與乳腺癌多柔比星耐藥相關(guān)的分泌蛋白。通過基于肽段譜圖計(jì)數(shù)的非標(biāo)記定量方法，我們篩查到了89個(gè)在MCF-7細(xì)胞和MCF-7/Dox細(xì)胞間差異表達(dá)的分泌蛋白，其中57個(gè)是首

3、次被報(bào)道與乳腺癌多柔比星耐藥相關(guān)。在這57個(gè)蛋白質(zhì)中，有13個(gè)已被報(bào)道與癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)，是潛在的在癌癥轉(zhuǎn)移和化療耐受中發(fā)揮雙重作用的分泌蛋白，非常有希望成為新的有效的治療靶點(diǎn)。我們進(jìn)一步驗(yàn)證了其中的IL-18與乳腺癌耐受多柔比星的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-18的表達(dá)量在耐受多柔比星的細(xì)胞系和乳腺癌組織中顯著上調(diào);癌細(xì)胞在有或無IL-18的情況下，對(duì)多柔比星的耐受能力顯著變化。這些研究結(jié)果表明，IL-18除了在乳腺癌轉(zhuǎn)移中具有作用，也在癌

4、細(xì)胞耐藥中發(fā)揮重要作用，是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的具有雙重作用的分泌蛋白。同時(shí)，在開展乳腺癌耐藥分泌組學(xué)研究的過程中，我們結(jié)合數(shù)據(jù)分析的需要，建立了一套分泌組學(xué)研究中常規(guī)使用的數(shù)據(jù)分析方法，如蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析方法和基于肽段譜圖計(jì)數(shù)的非標(biāo)記定量方法，從而在實(shí)驗(yàn)室全面完善了分泌組學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)技術(shù)與數(shù)據(jù)分析方法，形成了一套完整的分泌組學(xué)研究方法。
　　接著，本論文將凝集素親和捕獲技術(shù)引入到基于細(xì)胞培養(yǎng)的分泌組學(xué)研究中，建立了有效降低胞內(nèi)蛋白污染

5、、提高分泌蛋白鑒定效率的方法。在前面開展分泌組學(xué)研究時(shí)，我們遇到了和其他研究者一樣的問題，即:因不可避免的細(xì)胞死亡而釋放的大量胞內(nèi)蛋白顯著掩蓋了含量甚微的分泌蛋白的檢測(cè)。在本論文的研究工作中，我們首次將凝集素親和捕獲技術(shù)應(yīng)用于富集細(xì)胞（MCF-10A和MDA-MB-231）無血清培養(yǎng)液中的分泌蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)凝集素捕獲后，在MCF-10A細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞中，分泌蛋白的檢出數(shù)量分別從183增加至292、從194增加至3

6、68，并且鑒定到的在MCF-10A細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞間差異表達(dá)的分泌蛋白數(shù)量顯著增加。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，凝集素親和捕獲技術(shù)能有效的富集分泌蛋白并顯著提高分泌蛋白的檢出數(shù)量，有利于對(duì)分泌蛋白質(zhì)組進(jìn)行更全面、更詳盡的比較和分析，為更好的進(jìn)行分泌蛋白質(zhì)組的分析和比較奠定了基礎(chǔ)。
　　最后，在凝集素親和捕獲技術(shù)的基礎(chǔ)上，使得我們有能力開展基于新鮮組織培養(yǎng)的癌癥分泌組學(xué)研究，在更貼近生理狀態(tài)的情況下研究腫瘤組織的分泌組學(xué)。我們收

7、集了9對(duì)配對(duì)的早期結(jié)直腸癌和遠(yuǎn)端正常組織的無血清培養(yǎng)液，利用凝集素親和捕獲技術(shù)富集了其中的分泌蛋白，進(jìn)一步利用GeLC-MS/MS技術(shù)鑒定了捕獲到的蛋白質(zhì)。通過采用基于肽段譜圖計(jì)數(shù)的非標(biāo)記定量方法，我們篩查到了123個(gè)在結(jié)直腸癌組織和正常組織中顯著差異表達(dá)的分泌蛋白，其中68個(gè)在癌組織中表達(dá)量顯著上調(diào)。我們對(duì)其中的一個(gè)蛋白質(zhì)，EFEMP2，采用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)（免疫印跡、免疫組化、免疫酶聯(lián)反應(yīng)）在組織水平和血清水平進(jìn)行了詳盡的后期驗(yàn)證工作。

8、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EFEMP2在結(jié)直腸癌患者的癌組織和血清中的表達(dá)量顯著上調(diào)，包括結(jié)直腸癌早期患者;此外，受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic，ROC)分析結(jié)果顯示，EFEMP2和目前臨床上使用的輔助結(jié)直腸癌診斷的生物標(biāo)志物CEA的ROC曲線下面積分別為0.923和0.728，說明EFEMP2用于結(jié)直腸癌診斷的準(zhǔn)確性顯著優(yōu)于CEA。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果都說明，EFEMP2是非常有潛力的結(jié)直腸癌早期診

9、斷的血清生物標(biāo)志物。
　　總的來說，在本論文的研究工作中，我們首先優(yōu)化了基于細(xì)胞培養(yǎng)的分泌組學(xué)研究方法，并將其運(yùn)用于乳腺癌耐受多柔比星相關(guān)分泌蛋白的研究中，找到了一系列在化療耐受和癌癥轉(zhuǎn)移中發(fā)揮雙重作用的分泌蛋白。在此基礎(chǔ)上，我們?cè)诩?xì)胞系水平建立了基于凝集素親和捕獲的分泌組學(xué)研究方法，顯著提高了分泌蛋白的檢出效率和檢出數(shù)量。之后，我們進(jìn)一步將該方法運(yùn)用于基于新鮮組織培養(yǎng)的結(jié)直腸癌分泌組學(xué)研究，找到了一系列有潛力成為結(jié)直腸癌早期診斷