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文檔簡介
1、目的:遲發(fā)性腦血管痙攣(DCVS)是動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后致死、致殘的主要原因。炎性相關(guān)基因尤其是炎性細(xì)胞因子在痙攣動脈中表達(dá)增加表明腦血管炎性反應(yīng)可能參與了持續(xù)性腦血管痙攣形成。核因子-κB(NF-κB)是一個廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子,通過調(diào)控炎癥相關(guān)黏附分子和細(xì)胞因子的表達(dá)在炎癥應(yīng)答中起著重要的作用。有研究表明,辛伐他汀除降血脂作用之外,尚具有一定的抗炎作用。本研究中我們采用兔枕大池二次注血腦血管痙攣模型,觀察經(jīng)口灌服辛伐他汀
2、對家兔基底動脈中NF-κB表達(dá)的影響及對DCVS的預(yù)防作用,為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法:雄性新西蘭大白兔64只(由華北制藥廠質(zhì)檢中心提供),體重1.8~2.2kg,隨機(jī)分為四組:①SAH組(n=24):采用枕大池二次注血制作SAH模型,在氯胺酮(30mg/kg)、氯丙嗪(10mg/kg)肌注麻醉下,受試動物取俯臥頭低位,枕部手術(shù)區(qū)剃毛備皮常規(guī)消毒后用4.5號注射器針頭行枕大池穿刺,緩慢抽取腦脊液約1ml,隨后取未抗凝耳動脈血(1
3、.0ml/kg體重)于3分鐘內(nèi)緩慢注入枕大池,保持頭低腳高位(與地面成30°角)30分鐘,48小時后重復(fù)上述過程,并分別在第一次注血后Day4、Day7、Day14分三批處死,每批8只;②SAH+辛伐他汀治療組(n=24):按劑量不同分為2.5mg/kg、5mg/kg和7.5mg/kg三個亞組(各8只),第一次注血后Day7處死;③SAH+安慰劑(ADT)(n=8):予淀粉片7.5mg/kg代替辛伐他汀,第一次注血后Day7處死;④假手
4、術(shù)組(n=8):受試動物僅做枕大池假穿刺假注血,第一次注血后Day7處死以作對照。 HE、免疫組化檢查及免疫蛋白印跡(WesternBlot)分析:實驗動物用氯胺酮50mg/kg快速靜推,斷頭處死,取含有基底動脈全長的腦干組織,其中上1/2部分置于4%多聚甲醛溶液固定48小時,供組織學(xué)及免疫組化檢查;將余下的1/2段基底動脈迅速剝離,放入液氮中保存以備WesternBlot檢測。 采用華東理工大學(xué)自動化所細(xì)胞免疫組織化學(xué)
5、分析系統(tǒng)Version2.0自動分析儀記錄陽性細(xì)胞百分率。各組數(shù)據(jù)均用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。應(yīng)用AlphalmagerTM1220Documentation&AnalysissystemV5.50對免疫蛋白印跡結(jié)果進(jìn)行定量分析,其面積灰度值以積分光密度值(internalopticaldensity,IOD)表示。 應(yīng)用SPSS10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計處理。兩樣本均數(shù)間的比較用t檢驗;多樣本均數(shù)間的比較用單因素方差分析,以
6、P<0.05為有顯著差異。 結(jié)果:1.HE染色結(jié)果:光鏡下顯示假手術(shù)組動物基底動脈組織結(jié)構(gòu)正常。而SAH組和SAH+安慰劑(ADT)組動物于Day7時基底動脈均出現(xiàn)不同程度管徑變窄,管壁增厚,內(nèi)膜出現(xiàn)皺折,此兩組間內(nèi)徑比較,無明顯差異(P>0.05)。SAH+辛伐他汀組血管痙攣程度明顯減輕,并有一定量效關(guān)系,與SAH組、SAH+ADT兩組相比基底動脈內(nèi)徑狹窄程度有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)(Fig1,Table1,Table2)
7、。2.免疫組化結(jié)果:當(dāng)不用一抗或被同類型的對照抗體替換時,DAB染色缺乏。免疫組化結(jié)果顯示NF-κB(及TNF-α)在假手術(shù)組少量表達(dá),而在SAH組和SAH+ADT組在day7時間點表達(dá)增加。NF-κB在胞漿內(nèi)和胞核內(nèi)表達(dá),血管內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞均有NF-κB的表達(dá)(Fig2)。TNF-α在血管內(nèi)皮細(xì)胞與外膜細(xì)胞均有表達(dá)(Fig3)。在辛伐他汀治療組NF-κB(及TNF-α)表達(dá)明顯減弱并存在劑量依賴性,與SAH組和SAH+ADT組比
8、較有顯著差異(P<0.01)(Table-3,Table-4)。3.免疫蛋白印記結(jié)果:假手術(shù)組NF-κB(或TNF-α)(Fig4、5)的IOD值為1196±593(1368±553),SAHDay7亞組NF-κB(或TNF-α)的IOD值為10912±636(8894±382)。假手術(shù)組與SAHDay7組IOD值比較有顯著差異(Table-3,P<0.05)。SAH+ADT組NF-κB(或TNF-α)的IOD值為8903±593(91
9、97±644),與SAH組比較無顯著差異(P>0.05)。在SAH+辛伐他汀治療組三個劑量亞組NF-κB(或TNF-α)的I0D值分別為2989±135(3417±99),2107±153(2746±177),1595±136(1974±185);與SAH組和SAH+ADT組比較有顯著差異并存在劑量依賴性(P<0.01)(Table-5,Table-6)。 結(jié)論:經(jīng)口給予辛伐他汀能夠緩解兔枕大池二次注血造成的遲發(fā)性腦血管痙攣且與
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