高原肺水腫的遺傳易感性研究.pdf

1、高原肺水腫（HAPE）是一種特發(fā)于高原低氧環(huán)境的肺水腫。血漿中含有反映人體健康與各種疾病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的豐富信息，有大量能診斷人類(lèi)各種疾病的細(xì)胞因子、激素、多肽與蛋白質(zhì)，其含量改變的檢測(cè)，對(duì)闡述疾病病理生理學(xué)機(jī)制、疾病早期診斷、藥物效應(yīng)和不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)具有重要意義。功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究過(guò)程中所需要的重要實(shí)驗(yàn)步驟之一就是對(duì)復(fù)雜的體液樣品進(jìn)行逐一分離、分析與鑒定，其分析結(jié)果用于篩選各種疾病的標(biāo)志物。二維凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)是一種尋找差異蛋白質(zhì)

2、的高通量的方法，可以有效地在血漿中尋找疾病相關(guān)標(biāo)志物，為疾病的預(yù)防、診斷及治療提供重要的依據(jù)。目前，血漿蛋白質(zhì)組學(xué)在高原性疾病中的研究還十分有限，對(duì)HAPE易感者的早期預(yù)測(cè)和診斷缺乏有效的血漿生物指標(biāo)。
　　人類(lèi)基因組計(jì)劃和國(guó)際單倍型圖譜的構(gòu)建完成，打開(kāi)了通往研究復(fù)雜疾病的大門(mén)。目前，對(duì)候選基因、候選多態(tài)性位點(diǎn)以及基因組層面的多個(gè)基因、區(qū)域和位點(diǎn)的相關(guān)性分析，是現(xiàn)今研究人類(lèi)疾病的一個(gè)主要方向。全基因組關(guān)聯(lián)研究（Genome-wid

3、e Association Stud，GWAS）是一種檢測(cè)復(fù)雜疾病發(fā)病易感區(qū)域和相關(guān)基因的強(qiáng)有力的方法，高密度商業(yè)化的SNP芯片及高通量基因型檢測(cè)平臺(tái)和生物信息分析方法的出現(xiàn)，作為綜合的、高精度的方法，能在全基因組中高效檢測(cè)出一般等位基因與相應(yīng)表型的關(guān)聯(lián)，現(xiàn)得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，是一種尋找疾病標(biāo)記物的強(qiáng)有力的方法。根據(jù)結(jié)果篩選相關(guān)候選區(qū)域、基因、位點(diǎn)，并在大規(guī)模人群中進(jìn)行驗(yàn)證分析，已成為基本的研究策略。
　　本研究以在青海省玉樹(shù)地

4、區(qū)執(zhí)行援建任務(wù)的建筑工人為研究對(duì)象，應(yīng)用雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜的方法，研究HAPE患者在急性期與康復(fù)期血漿蛋白質(zhì)組差異；采用全基因組關(guān)聯(lián)和候選基因分析方法，研究HAPE遺傳易感機(jī)制；旨在從分子水平探討導(dǎo)致HAPE發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸可能的差異功能蛋白與基因結(jié)構(gòu)及相關(guān)多態(tài)性位點(diǎn)，為將來(lái)進(jìn)行臨床應(yīng)用和干預(yù)提供科學(xué)依據(jù)。本文主要從以下幾部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 高原肺水腫患者急性期與恢復(fù)期血漿蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　目的：
　　采

5、用差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析高原肺水腫患者急性期與恢復(fù)期血漿蛋白質(zhì)組，篩選HAPE血漿生物標(biāo)記物。
　　方法：
　　1.樣本選擇：根據(jù)HAPE的診斷標(biāo)準(zhǔn)，從援建工人中收集并選取3例HAPE患者，收集急性期入院血漿和康復(fù)后血漿；
　　2.去除血漿高豐度蛋白；
　　3.雙向凝膠電泳；
　　4.差異分析和質(zhì)譜鑒定及驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　急性期，載脂蛋白A-I、血漿淀粉樣蛋P、纖維蛋白原、免疫球蛋白等表達(dá)

6、上調(diào)；在恢復(fù)期，載脂蛋白A-IV、抗凝血酶、抗體蛋白等表達(dá)上調(diào)。血漿載脂蛋白A-I水平在HAPE急性期和高原健康對(duì)照組均上調(diào)，較平原組高（P<0.05），高原健康對(duì)照組較HAPE急性期高（P<0.05），恢復(fù)期血漿載脂蛋白A-I水平與平原組相當(dāng)。血漿載脂蛋白A-IV水平在HAPE組和高原健康對(duì)照組較平原組均下調(diào)（P<0.05），HAPE恢復(fù)期較HAPE急性期和高原健康對(duì)照組高（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　在環(huán)境低氧的刺

7、激下，血漿ApoA-I含量顯著增加，作為一個(gè)具有抗炎、抗氧化作用的有益保護(hù)因子，可能是減少急性高原病罹患的因素之一。ApoA-I可以作為高原肺水腫的血漿標(biāo)記物之一。
　　第二部分 采用Affimatrix SNP6.0芯片進(jìn)行高原肺水腫全基因組關(guān)聯(lián)分析
　　目的：
　　本部分采用Affymetix6.0芯片掃描技術(shù)及全基因組關(guān)聯(lián)分析研究篩查HAPE的遺傳易感位點(diǎn)與基因，并對(duì)篩選的遺傳易感基因及相關(guān)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)研

8、究。
　　方法：
　　1.高原肺水腫全基因組關(guān)聯(lián)分析：1)樣本選擇：根據(jù)HAPE的診斷標(biāo)準(zhǔn)，從援建工人中收集并選取40例HAPE患者和33例嚴(yán)格匹配的對(duì)照個(gè)體；2)分型：采用Affymetrix SNP Array6.0進(jìn)行樣本的全基因組SNP分型；3）關(guān)聯(lián)分析：通過(guò)plink軟件對(duì)芯片掃描結(jié)果進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。
　　2.對(duì)候選SNP的關(guān)聯(lián)研究：1)選取138例HAPE患者、138例與HAPE匹配的健康平原對(duì)照、1

9、37例玉樹(shù)藏族健康對(duì)照；2）分型：采用iMLDR技術(shù)進(jìn)行候選SNPs分型；3）關(guān)聯(lián)分析：樣本群體SNP位點(diǎn)多樣性進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，以檢驗(yàn)樣本的代表性。組間SNP位點(diǎn)，基因頻率、基因型頻率分布采用卡方檢驗(yàn)，單獨(dú)或（和）聯(lián)合相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)關(guān)聯(lián)分析，篩選出57個(gè)SNP位點(diǎn)分別處于74個(gè)基因內(nèi)或上下游區(qū)域，分析發(fā)現(xiàn)這些基因與血管內(nèi)皮功能、肺臟發(fā)育、炎癥損傷等相關(guān)，提示與HAPE發(fā)病密切

10、相關(guān)，為進(jìn)一步開(kāi)展關(guān)聯(lián)研究提供了線索。
　　2.經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)所有SNP位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg檢驗(yàn)平衡定律。HAPE組rs4906864的基因型TT在HAPE-p組（14.8％）和HAPE-r（0.08%）組間差異有顯著性（P<0.05），odds ratio為0.425(0.187-0.966)；等位基因T在HAPE-p組（38.5%）和HAPE-r（29.9%）組間差異有顯著性（P<0.05），odds ratio

11、為0.682(0.477-0.973)。
　　結(jié)論：
　　高原肺水腫受遺傳多態(tài)性影響，與“前列腺素代謝”、“四烯酸代謝”、“氮代謝”過(guò)程中的多個(gè)基因以及位點(diǎn)相關(guān)；其中，rs4906864的基因型TT和等位基因T在HAPE-p組和HAPE-r組間差異有顯著性，與HAPE病理生理過(guò)程相關(guān)。
　　第三部分 候選基因的關(guān)聯(lián)研究
　　目的：
　　對(duì)候選基因EPAS1外顯子序列及內(nèi)含子區(qū)域SNPs、ACE基因I/D多態(tài)

12、性進(jìn)行分析和關(guān)聯(lián)研究。
　　方法：
　　1.EPAS1基因外顯子區(qū)域掃描分析：1)樣本選擇：根據(jù)HAPE的診斷標(biāo)準(zhǔn)，從援建工人中收集并選取40例HAPE患者和40例嚴(yán)格匹配的對(duì)照個(gè)體；2）采用分段設(shè)計(jì)引物釣取EPAS1基因全部16個(gè)外顯子并測(cè)序。
　　2.EPAS1基因候選SNP[Chr2:46441523(hg18)]關(guān)聯(lián)研究：1)樣本選擇：選取153例HAPE患者，298例健康平原對(duì)照，245例玉樹(shù)藏族健康對(duì)照；2

13、)分型：采用PCR-RFLP法檢測(cè)EPAS1基因[Chr2:46441523(hg18)]多態(tài)性；3）關(guān)聯(lián)分析：實(shí)驗(yàn)樣本群體SNP位點(diǎn)多樣性進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，以檢驗(yàn)樣本的代表性。組間SNP位點(diǎn)，基因頻率、基因型頻率分布采用卡放檢驗(yàn)。
　　3.EPAS1基因內(nèi)含子區(qū)域SNPs關(guān)聯(lián)研究：1)樣本選擇：選取135例HAPE患者，137例健康平原對(duì)照，135例玉樹(shù)藏族健康對(duì)照；2)分型：采用iMLDR技術(shù)進(jìn)行候選S

14、NPs分型；3）關(guān)聯(lián)分析：樣本群體SNP位點(diǎn)多樣性進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，以檢驗(yàn)樣本的代表性。組間SNP位點(diǎn)，基因頻率、基因型頻率分布采用卡放檢驗(yàn)。
　　4.ACE基因I/D多態(tài)性關(guān)聯(lián)研究：1)樣本選擇：HAPE患者147例，健康平原對(duì)照193例；2)分型：ACE基因I/D多態(tài)性通過(guò)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測(cè)；3）關(guān)聯(lián)分析：樣本群體SNP位點(diǎn)多樣性進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，以檢驗(yàn)樣本的代表性。組間SN

15、P位點(diǎn)，基因頻率、基因型頻率分布采用卡放檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1.HAPE患者和健康對(duì)照者EPAS1基因外顯子序列未改變，位于外顯子5和外顯子6之間的SNP位點(diǎn)[Chr2:46441523(hg18)]的基因頻率在HAPE組和對(duì)照組之間存在差異。
　　2.EPAS1基因SNP[Chr2:46441523(hg18)]的基因型CG的頻率，在HAPE-p組與HAPE-r組間差異有顯著性（P=0.026，CI=1.068-

16、22.212），兩組中等位基因 C的頻率分別為92.5%、75.2%，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001，CI=0.155-0.391）。HAPE-p組和HAPE-r與HLT基因型頻率和等位基因頻率均有極顯著性差異（P<0.000）。
　　3.EPAS1基因內(nèi)含子區(qū)域rs10193827、rs4953359的基因型CC在HAPE-p組和HAPE-r組間差異有顯著性（P<0.001）；rs13419896、rs17035010、r

17、s6544889的基因型GG、TT、AA在HAPE-p組和HAPE-r組間差異有顯著性（P<0.001）；rs10193827和rs6544889基因型分別在顯性和隱性模式下，與HAPE發(fā)病的危險(xiǎn)度高；rs10193827、rs11675232、rs13419896、rs17035010、rs1992846、rs4953359、rs6544889、rs7589621、rs10206434、rs13006131、rs1562453、rs1

18、868092、rs4953354、rs4953361、rs7571218、rs7598371的基因型CC、TT、GG、TT、TT、TT、AA、AA、GG、CC、CC、GG、AA、GG、AA、GG在漢族和藏族差異有顯著性（P<0.001）；EPAS1基因與藏族人群高原適應(yīng)機(jī)制密切相關(guān)。
　　4.ACE基因I/D多態(tài)性在HAPE組和對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　EPAS1基因與HAPE發(fā)病相關(guān)；ACE基因I