虎杖苷對(duì)高原肺水腫模型大鼠的防治作用及其機(jī)制研究.pdf

1、1.研究背景：
　　高原肺水腫（highaltitudepulmonaryedema,HAPE）是由于人體進(jìn)入高原速度過快或在高原地區(qū)劇烈運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致耗氧量增加而引起的一種嚴(yán)重威脅生命的急性重癥高原病，如搶救不及時(shí)常威脅生命。一般認(rèn)為高原低氧是HAPE的誘發(fā)因素之一，缺氧導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓升高及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，肺毛細(xì)血管壁和肺泡上皮細(xì)胞通透性增加是HAPE的基本病理特征。HAPE的發(fā)病率在0.5％～9.9％之間，通常在海拔3000米以上地

2、區(qū)發(fā)生，并隨著海拔的增高，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。我國海拔3000米以上的高原占國土面積的1/4以上，因此HAPE發(fā)生機(jī)制及其防治一直是我國高原醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)問題。近年來，隨著HAPE的深入研究，其臨床治愈率明顯提高。但現(xiàn)有的各種發(fā)病機(jī)制尚不能完全解釋HAPE的病理生理改變，特別是現(xiàn)有藥物對(duì)HAPE所致肺動(dòng)脈高壓的選擇性較差，降低肺血管阻力特點(diǎn)不明顯，作用靶點(diǎn)單一，副作用較大，因而限制其臨床療效和應(yīng)用。
　　隨著天然藥物研究的不斷推進(jìn)，

3、越來越多的生藥及其活性組分逐漸被人們發(fā)現(xiàn)和認(rèn)可，在西醫(yī)常規(guī)治療HAPE的基礎(chǔ)上，充分發(fā)揮天然藥物的優(yōu)勢(shì)，積極發(fā)現(xiàn)并篩選出安全有效的活性成分，闡明其作用機(jī)制，可為我們治療HAPE提供新的思路?；⒄溶眨≒olydatin，PD）是從植物虎杖中提取得到的一種天然單體活性成分，具有改善微循環(huán)，抑制血小板聚集，降低血漿粘度，抗脂質(zhì)過氧化和抗病原微生物等作用?；⒄鹊奶崛∫嚎擅黠@降低缺氧引起的肺動(dòng)脈高壓，而且對(duì)肺血管具有一定的選擇性。本實(shí)驗(yàn)室前期研究

4、發(fā)現(xiàn)PD可通過增加大鼠血清、肺組織中NO含量和增強(qiáng)NOS活性等途徑降低肺動(dòng)脈高壓、抑制肺血管重建。
　　本課題通過模擬高原環(huán)境，采用低壓低氧加復(fù)合運(yùn)動(dòng)的方法建立HAPE模型大鼠，觀察PD對(duì)HAPE模型大鼠血流動(dòng)力學(xué)、血液流變學(xué)、血管活性因子以及對(duì)缺氧培養(yǎng)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Pulmonarymicrovascularendothelialcells，PMVECs）的影響，從整體、細(xì)胞水平探討其作用機(jī)制，為闡明PD降低肺動(dòng)脈高壓，防

5、治HAPE提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，以期為臨床治療HAPE提供新方法。
　　2.研究目的：
　　研究PD對(duì)高原肺水腫模型大鼠的治療作用及其機(jī)制。
　　3.研究方法：
　　3.1.PD對(duì)HAPE模型大鼠血流動(dòng)力學(xué)和血?dú)獾挠绊?br>　　3.1.1.將健康SD大鼠隨機(jī)均分為6組，即正常對(duì)照組、HAPE模型組（ig.0.5％羧甲基纖維素鈉5mL·Kg-1）、PD低、中、高劑量組（ig.20、40、80mg·Kg-1PD）、陽性藥物

6、對(duì)照組（ig.50mg·Kg-1PF）。
　　3.1.2.通過右心漂浮導(dǎo)管法測(cè)定大鼠肺血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)（PASP、PADP、mPAP），同時(shí)記錄心率（HR）。取左頸總動(dòng)脈血，測(cè)定血?dú)猓≒aO2、PaCO2和SaO2、）。計(jì)算肺體系數(shù)及RV/（LV+S）重量比值，求出右心室肥厚指數(shù)（RVHI）。
　　3.2.PD對(duì)HAPE模型大鼠血液流變學(xué)及血管活性因子影響
　　3.2.1.動(dòng)物分組、給藥及建立HAPE模型方法均與上述3.

7、1.1方法相同。
　　3.2.2.將大鼠用1％戊巴比妥鈉麻醉后，頸動(dòng)脈插管取血4ml，分別進(jìn)行全血粘度、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、血小板聚集功能、血小板粘附功能測(cè)定。
　　3.2.3.取大鼠動(dòng)脈血3ml，按酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定內(nèi)皮素-1（ET-1）含量；用放免法測(cè)定血栓素A（TXA2）和前列環(huán)素（PGI2）的代謝產(chǎn)物血栓素B（TXB2）和6-酮-前列腺素（6-keto-PGFla）的含量。
　　3.2.4.取右肺組織勻

8、漿，離心取上清液，按酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定ET-1含量。另取左肺組織勻漿，離心取上清液，采用ELISA法測(cè)定VEGF含量。
　　3.3.PD對(duì)缺氧所致大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（PMVECs）損傷的影響
　　3.3.1.取健康SD大鼠肺組織進(jìn)行體外培養(yǎng)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（PMVECs），選取生長良好的PMVECs（1×105個(gè)細(xì)胞/ml）種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入200μl低糖DMEM（含有5％胎牛血清，青霉素100U/ml，鏈霉素1

9、00μg/ml）同步化培養(yǎng)24h。然后分成八組：常氧空白組（21％O2，5％CO2，74％N2），常氧+PD低、中、高劑量組(30μmol·L-1、60μmol·L-1、120μmol·L-1)，低氧空白組（1％O2，5％CO2，94％N2），低氧+PD低、中、高劑量組(30μmol·L-1、60μmol·L-1、120μmol·L-1)?？瞻捉M僅加入200μl低糖DMEM培養(yǎng)液，給藥組加入200μl按上述濃度配好的含藥低糖DMEM培養(yǎng)

10、液。
　　3.3.2.常氧條件下用MTT法檢測(cè)PD對(duì)PMVECs的細(xì)胞。
　　3.3.3.根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)的培養(yǎng)液，在三氣培養(yǎng)箱中設(shè)置常氧、低氧條件后，MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度值。
　　3.3.4.采用LDH測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH活性。
　　3.3.5.根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)的培養(yǎng)液，通過SABC法免疫組化染色，檢測(cè)各組中VEGF的表達(dá)。
　　3.3.6.根據(jù)

11、實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)的培養(yǎng)液，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中VEGF的含量。
　　4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　4.1.PD對(duì)HAPE模型大鼠肺血流動(dòng)力學(xué)和血?dú)獾挠绊?br>　　模型組PASP、PADP、mPAP均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；PD低劑量組PASP、PADP、mPAP均高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；PD中、高劑量組及陽性對(duì)照組與模型組相比，能顯著降低肺動(dòng)脈高壓（P＜0.05或P＜0.01），且P

12、D中、高劑量組作用效果與陽性藥物對(duì)照組相當(dāng)。血?dú)夥治鲲@示：與正常對(duì)照組比較，模型組PaO2和SaO2均顯著降低（P<0.05），PaCO2無明顯變化；與模型組相比，PD中、高劑量組及陽性藥物組，能使PaO2和SaO2顯著升高（P<0.05）。
　　模型組大鼠的肺質(zhì)量、肺體系數(shù)分別比正常對(duì)照組平均增加33.91％、65.83％，說明肺水腫程度明顯（P<0.05）；與模型組比較，虎杖苷中、高劑量治療組和陽性藥物組肺質(zhì)量和肺體系數(shù)均明顯

13、減輕（P<0.05或P<0.01），虎杖苷各給藥組與陽性藥物對(duì)照組無明顯差異（P>0.05）。
　　與正常對(duì)照組比較，模型組右心室肥厚指標(biāo)均明顯升高（P<0.05或P<0.01）；與模型組比較，虎杖苷中、高劑量組能有效地抑制低壓低氧引起的大鼠心臟指數(shù)的升高，從而對(duì)抗大鼠右室肥厚的形成（P<0.05）。
　　4.2.PD對(duì)HAPE模型大鼠血液流變學(xué)和血管因子的影響
　　模型組與正常組對(duì)照組比較，血漿粘度及全血高切變率粘度

14、、低切變率粘度指標(biāo)均增高，均具有顯著差異（P<0.05或P<0.01）；PD各劑量組及阿魏酸哌嗪組，與模型組比較在降低血漿粘度及高、低切變率下的全血粘度上具有顯著性差異(P<0.05)；但PD低劑量組對(duì)全血粘度影響較小，僅顯示下降趨勢(shì)。
　　與模型組大鼠比較，PD各劑量組及陽性藥物組均可顯著降低紅細(xì)胞壓積和聚集指數(shù)并降低纖維蛋白原含量(P<0.01)；PD各劑量組與模型組比較，顯著降低血小板聚集率和血小板粘附率（P<0.05或P<

15、0.01）。
　　PD中、高劑量組和陽性藥物組均可明顯降低血漿ET-1、TXB2水平，增加血漿PGF1α及PGF1α/TXB2比值（P<0.05或P<0.01）。
　　PD中、高劑量組和陽性藥物組大鼠肺組織ET-1含量明顯減少（P<0.05），但與正常對(duì)照組相比，均未達(dá)到正常值水平（P>0.05）；PD高劑量組和陽性藥物組使大鼠肺組織VEGF含量下降明顯（P<0.05）。
　　4.3.PD對(duì)缺氧培養(yǎng)的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)

16、胞（PMVECs）的影響
　　在常氧條件下，經(jīng)MTT法檢測(cè)，PD各劑量組（30、60、120μmol·L-1），與正常對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率無明顯變化（P>0.05）。
　　與常氧空白組比較，低氧空白組PMVECs數(shù)量顯著減少（P<0.05）；與低氧空白組比較，PD各劑量組PMVECs活性顯著提高（P<0.05或P<0.01）,且隨PD濃度增加,對(duì)低氧所致PMVECs抑制作用對(duì)抗增強(qiáng),并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。
　　與常氧

17、空白組比較,低氧組細(xì)胞上清中LDH活力明顯升高，具有顯著性差異（P<0.05），PD各劑量組均能顯著減少缺氧引起LDH釋放（P<0.05），且表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。
　　VEGF免疫組化染色后檢視，可見常氧組染色不明顯；而低氧空白組染色較深，PD給藥中、高劑量組染色變淺，說明PD對(duì)低氧所致PMVECs的VEGF表達(dá)增加有一定的抑制作用。
　　ELISA法檢測(cè)PMVECs在常氧和低氧條件下PD干預(yù)后VEGF含量的變化，以吸

18、光度為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，建立VEGF標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，C=-102.1045A+779.4202，r=0.9997，VEGF含量在0～1000pg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。低氧環(huán)境下VEGF顯著增高（P<0.01）；低氧環(huán)境下給藥組VEGF含量顯著下降（P<0.05）；而常氧給藥組與空白組相比較無顯著性差異（P>0.05）。
　　5.結(jié)論：
　　5.1.PD能夠降低HAPE模型大鼠肺動(dòng)脈高壓，改善肺血管收縮狀態(tài)。PD在短時(shí)間

19、內(nèi)使PaO2和SaO2顯著升高，改善氧合，產(chǎn)生對(duì)急性低氧的適應(yīng)，降低肺血管阻力，從而降低肺動(dòng)脈壓，降低肺水腫程度。
　　5.2.PD具有的改善血液循環(huán)的作用可能使HAPE模型大鼠的高粘度血液、變形力下降的紅細(xì)胞流經(jīng)血管床時(shí)，血流速度加快、血管阻力下降，從而改善了肺血管的微循環(huán)，使模型大鼠肺動(dòng)脈壓下降。
　　5.3.PD具有對(duì)抗低氧誘導(dǎo)PMVECs氧化損傷的作用。PD還能直接抑制低氧所致的VEGF表達(dá)增加，說明PD在低氧環(huán)境下