利用GST-標(biāo)簽大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備HPV58E7蛋白.pdf

1、研究背景：宮頸癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的惡性腫瘤之一，已證實(shí)，宮頸癌的發(fā)生與高危型人乳頭瘤病毒（HPV）感染關(guān)系密切，總體來說，HPV16,18型在全球范圍內(nèi)占主導(dǎo)地位,但高危型別HPV的流行與分布亦有明顯的地域特點(diǎn)，已有研究表明，在中國(guó)及亞洲，HPV58是一個(gè)不容忽視的型別。高危型HPVE6、E7蛋白是HPV的主要轉(zhuǎn)化蛋白。E6蛋白可與抑癌基因產(chǎn)物p53蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，并通過泛素系統(tǒng)降解，從而阻斷p53蛋白對(duì)細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控功能，這可

2、能是E6蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化和永生化的主要機(jī)制。而E7蛋白與pRB蛋白作用，通過降解pRb抑癌蛋白，使E2F游離，E2F下游基因活化，影響細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，促進(jìn)細(xì)胞通過G1/S檢查點(diǎn)（checkpoint），引起細(xì)胞增殖加快，進(jìn)而引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。HPV癌蛋白對(duì)生物因子相關(guān)的宮頸癌來說，表現(xiàn)為腫瘤特異性相關(guān)抗原，可刺激腫瘤患者的特異性免疫反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)利用基因工程技術(shù)表達(dá)HPV58E7蛋白，為探討其免疫學(xué)特性，檢測(cè)宮頸癌患者對(duì)型特異性E7蛋白

3、的免疫反應(yīng)類型以及研究其細(xì)胞轉(zhuǎn)化機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：設(shè)計(jì)E7基因片段特異性PCR引物，以HPV58全基因組為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增E7基因片段，利用pGEX-4T3表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建pGEX-4T3/HPV58E7重組體，轉(zhuǎn)化BL21宿主細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)帶有GST標(biāo)簽的可溶性融合蛋白。經(jīng)谷胱甘肽凝膠柱親和層析純化，凝血酶切GST標(biāo)簽。
　　結(jié)果：SDS-PAGE分析顯示在分子量約為40KD處有新生蛋白條帶，經(jīng)凝血酶消化融