菌群構成與細菌性陰道病的相關性研究.pdf

1、研究背景:細菌性陰道病(BV)是育齡期婦女的常見病、多發(fā)病，是由于陰道內微生態(tài)平衡失調，非正常陰道菌生長過盛所致對陰道有保護作用的乳酸桿菌減少，厭氧類細菌大量繁殖導致的一類多微生物病。BV是妊娠婦女最主要的并發(fā)疾病，與胎兒低體重、早產(chǎn)、新生兒死亡及產(chǎn)婦繼發(fā)感染等不良妊娠結局有關。臨床用甲硝唑和克林霉素按標準方法治療BV，3月內復發(fā)率高達30％，其中最主要原因是對BV的病因，特別是病原學缺乏深入了解，很多細菌不易培養(yǎng)，導致陰道分泌物的病原

2、菌組成和分類研究進展緩慢，因而缺乏有效的預防和治療措施。
　　 近年來，不依靠細菌培養(yǎng)測定細菌種屬的分子生物學方法得到應用推廣，使研究者可以探索微生物群落內部的種群結構和變遷。本項目在前期研究的基礎上，以BV陽性和陰性婦女為研究對象，采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)和DNA測序技術分析細菌16S rDNA的特征序列信息，將16S rDNA與數(shù)據(jù)庫進行比對，從“屬”、“種”水平對陰道分泌物中的細菌類群進行鑒定。應用凝膠圖像分析系統(tǒng)

3、計算細菌種屬的相對含量。采用對應分析法證明BV相關細菌，采用logistic回歸分析不同菌群組成以及其他相關因素與BV的關聯(lián)，為進一步防治研究提供依據(jù)。
　　 研究目的:探討與BV相關的細菌種屬；研究正常陰道細菌和BV相關菌的相對含量與BV的相關性；探討人口學特征以及衛(wèi)生習慣等宏觀因素與BV的關聯(lián)性，為BV的病因研究提供線索，為BV的防治研究提供依據(jù)。
　　 研究內容和方法:
　　 一、陰道微生物群落的檢測方法:

4、采用革蘭氏染色Nugent評分法結合商業(yè)試劑盒對BV作出臨床診斷。以目前常用的DGGE方法為基礎，重新設計了DGGE實驗裝置的關鍵部件制膠板組件，擴展了DGGE方法的條帶分辨率范圍和裝置使用的靈活性，并采用切膠重新PCR擴增并測序的手段獲得細菌的16S rDNA遺傳信息，并與數(shù)據(jù)庫進行比對，以序列相似程度≥97.5％作為序列同源性標準。利用DGGE凝膠圖像分析系統(tǒng)計算每個細菌標本中各細菌種屬的相對含量，實現(xiàn)了對陰道微環(huán)境細菌群落的定性和

5、定量分析的有機結合。
　　 二、陰道菌群構成及其他相關因素與BV的相關性(BV的危險因素研究):用自行設計的調查問卷調查196名育齡期婦女，問卷內容包括一般人口學特征、衛(wèi)生習慣、婚育史以及主要婦科診斷等。采用對應分析法確定BV相關細菌，采取卡方檢驗分析不同細菌種屬在BV陽性組和BV陰性組的檢出率差異，采用t檢驗分析不同菌屬的相對含量在2組間的差異，logistic回歸分析不同菌群組成以及其他相關因素與BV的關聯(lián)強度。
　　

6、 研究結果:
　　 第一部分陰道微生物群落檢測方法的研究
　　 1.全部196名婦女共檢出細菌種屬59種，正常組檢出14種，BV組檢出55種。
　　 2.68名BV陰性婦女中，每名婦女可檢出1-5個不同菌屬，平均檢測到2.59種；128名BV陽性婦女中，每名婦女可檢測到1-9個不同菌屬，平均檢測到4.05種，二者比較有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.001)。
　　 3.正常組檢出率在前5位的細菌分別為惰性乳酸

7、桿菌(Lactobacillus iners)、ultunensis乳酸桿菌(Lactobacillus ultunensis)、雙歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、陰道加特納菌(Gardnerella vaginalis)和短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)；BV組檢出率在前5位的細菌分別為惰性乳酸桿菌(Lactobacillus iners)、陰道加特納菌(Gardnerella vag

8、inalis)、ultunensis乳酸桿菌(Lactobacillusultunensis)、陰道阿托波氏菌(Atopobium vaginae)和fungorum伯克霍爾德氏菌(Burkholderia fungorum)。
　　 4.細菌進化關系分析顯示59中檢出細菌分為2個大類，分別定義為陰道正常菌群，和BV相關菌群。其中陰道正常菌群包括雙歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、massiliae消化

9、鏈球菌(Peptostreptococcus massiliae)、Amnionii纖毛菌屬(Leptotrichia amnionii)、惰性乳酸桿菌(Lactobacillus iners)、ultunensis乳酸桿菌(Lactobacillus ultunensis)、和約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)共6種。
　　 5.研究發(fā)現(xiàn)有2個檢出的細菌種屬16S rDNA特征DNA序列與數(shù)據(jù)庫序列

10、的同源性<97.5％(96.835％vs Lactobacillus ultunensis；86.184％vs Mycoplasma muris)，可能為細菌新變種。
　　 第二部分細菌性陰道病的危險因素研究在第一部分的研究基礎上，本部分研究陰道菌群的構成和其他因素與BV發(fā)生的相關性，主要研究結果如下：
　　 1.與正常組和BV組相關聯(lián)的陰道菌群發(fā)現(xiàn)與正常組相關聯(lián)的細菌為兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bi

11、fidum)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、惰性乳桿菌(Lactobacillus iners)、ultunensis乳桿菌9Lactobacillus ultunensis)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)；與BV組相關聯(lián)的細菌為Algoriphagus aquatilis、陰道阿托波氏菌(陰道奇異菌)(Atopobiumvaginae)、fungorum伯克霍爾德氏菌

12、屬(Burkholderia fungorum)、陰道加德納氏菌(Gardnerella vaginalis)、genomosp巨球形菌(Megasphaera genomosp)。
　　 2.正常組和BV陽性組陰道微生態(tài)構成特點
　　 (1)乳酸桿菌在2個組中均為檢出的優(yōu)勢菌，總乳酸桿菌Lactobacillus在病例組和正常組中的檢出率分別為92.97％和95.59％，檢出率的差異無統(tǒng)計學意義(Fisher’s ex

13、actP=0.548)，但其在正常組中的含量顯著高于BV陽性組。
　　 (2)陰道加特納菌(Gardnerella vaginalis)作為細菌性陰道病的標志性細菌，在BV組中的檢出率和相對含量均高于正常組，但正常組也有比較高的檢出率，所以不能單純以陰道加特納菌陽性與否作為診斷BV的依據(jù)。
　　 (3)發(fā)現(xiàn)其他BV相關菌包括陰道阿托波氏菌(Atopobium vaginae)和普雷沃菌(Prevotella timone

14、nsis)，與文獻報道一致。
　　 (4)研究發(fā)現(xiàn)伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia fungorum)、micronuciformis巨球形菌(Megasphaera micronuciformis)、Algoriphagus aquatilis與BV相關，文獻報道較少，其與BV的真實聯(lián)系尚需進一步研究確證。
　　 (5)BV陽性組的細菌載量顯著高于正常組。
　　 3.多因素統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)BV的危險因素初

15、婚年齡較小、陰道pH值偏高、陰道乳酸桿菌含量低是發(fā)生BV的危險因素；妊娠的婦女患BV的危險性是已生育婦女的36倍，未孕育的婦女患BV的危險性是已生育婦女的4.08倍，但關聯(lián)沒有統(tǒng)計學意義；經(jīng)常陰道沖洗(用水洗或用消毒液洗)的婦女與偶爾陰道沖洗的婦女相比有更高的患BV危險性；具有高中及以上學歷者患BV的危險是初中及以下學歷者的4.98倍。
　　 結論:
　　 1.除陰道加特納菌Gardnerella vaginalis、陰

16、道阿托波氏菌(陰道奇異菌)(Atopobiumvaginae)作為細菌性陰道病的標志性細菌外，本研究發(fā)現(xiàn)其他BV相關菌包括(Algoriphagus aquatilis)、fungorum伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia fungorum)、genomosp巨球形菌(Megasphaera genomosp)。
　　 2.BV陽性陰道微環(huán)境細菌種類和細菌總量顯著高于正常對照，而正常對照的乳酸桿菌含量顯著高于BV陽性組。