受體活性修飾蛋白1過表達(dá)對降鈣素基因相關(guān)肽促MG-63增殖和分化作用的影響研究.pdf

1、外周感覺神經(jīng)所分泌的神經(jīng)肽類物質(zhì)對骨代謝和骨折修復(fù)重建具有重要生物學(xué)調(diào)控作用,部分神經(jīng)肽類物質(zhì)的促成骨增殖和分化作用在體內(nèi)外實驗中分別得以證實。降鈣素基因相關(guān)肽(calcitoningene-relatedpeptide,CGRP)在體內(nèi)有廣泛的分布和表達(dá),CGRP與降鈣素(calcitonin)來源于同一基因,在骨代謝、胃腸道、心血管和疼痛機制的調(diào)節(jié)中具有極其重要的病理及生理學(xué)意義。自從在骨痂中發(fā)現(xiàn)CGRP陽性神經(jīng)纖維表達(dá)開始,研究人

2、員通過轉(zhuǎn)基因小鼠和基因敲除小鼠等體內(nèi)實驗證明了CGRP的促成骨效應(yīng),也在體外實驗中發(fā)現(xiàn)了CGRP可以促進(jìn)成骨細(xì)胞(Osteoblast,OB)的增殖,并證實了成骨細(xì)胞表面CGRP受體的存在,并發(fā)現(xiàn)了其下游的環(huán)磷酸腺苷(CyclicAdenosinemonophosphate,cAMP),細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子(IntracellularCa2+,[Ca2+]i)和絲裂原激活激酶(mitogen-activatedproteinkinaseMA

3、PK)等信號通路。
　　本課題組已在前期實驗中證實CGRP能明顯刺激體外培養(yǎng)的人MG-63成骨細(xì)胞樣細(xì)胞和鼠成骨細(xì)胞的增殖和分化,并且探究了MG-63細(xì)胞蛋白質(zhì)組在CGRP參與的骨創(chuàng)傷修復(fù)過程中的變化。YANLi等實驗已發(fā)現(xiàn)CGRP在口腔頜面部骨創(chuàng)傷修復(fù)中的重要作用,并且在體外證實CGRP可影響成骨細(xì)胞的代謝。骨創(chuàng)傷修復(fù)過程中,新生的感覺神經(jīng)末梢在骨痂中分泌的CGRP等神經(jīng)肽類物質(zhì)促進(jìn)了骨創(chuàng)傷的修復(fù)重建。
　　CGRP受體位

4、于細(xì)胞膜上,由降鈣素受體樣受體(calcitoninreceptor-likereceptor,CRLR)、受體活性修飾蛋白(receptoractivitymodifyingproteins,RAMPs)和受體組分蛋白(receptorcomponentprotein,RCP)組成,屬于G蛋白偶聯(lián)受體,包括降鈣素受體(calcitoninreceptor,CTR)和CRLR。RAMP與CGRP受體的可塑性有關(guān),可調(diào)節(jié)CRLR與CGRP

5、的結(jié)合,不同的RAMP與CRLR結(jié)合表現(xiàn)為對不同配體具有特異的受體表型,從而介導(dǎo)CGRP的生物學(xué)效應(yīng)。目前發(fā)現(xiàn)RAMPs家族包含3個成員:RAMP1、RAMP2和RAMP3,RAMPs作為受體調(diào)節(jié)的限速蛋白,決定了配體的受體表型及作用強弱,但RAMP1表達(dá)與CGRP促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化的關(guān)系研究較少。
　　綜上所述,本項實驗通過構(gòu)建RAMP1真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞,觀察RAMP1過表達(dá)對CRLR表達(dá)量和膜分布的影響,探

6、究RAMP1過表達(dá)對CGRP促進(jìn)MG-63細(xì)胞增殖及分化作用的影響,為闡明神經(jīng)多肽系統(tǒng)在口腔頜面部骨創(chuàng)傷修復(fù)中的機制打下基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):人MG-63細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)。以5×106/瓶密度接種于100ml培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)傳代,加入含青霉素105U/L、鏈霉素100mg/L的10％FBS高糖DMEM培養(yǎng)基,置于5%CO2孵箱中37°C孵育72或96h傳代,6-8代細(xì)胞用于實驗,待細(xì)胞密度達(dá)到80%飽和時(

7、細(xì)胞達(dá)對數(shù)生長期)用于實驗分組。
　　2.實驗分組與操作程序:待細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,生長密度達(dá)到80%以上時,按106個/孔的密度將細(xì)胞接種于6孔板后采用完全隨機(完全隨機設(shè)計也叫組間設(shè)計,被試被分成若干組,每組分別接受一種實驗處理,有幾種實驗處理被試也相應(yīng)的被分為幾組,各實驗組的被試之間相互獨立,因而又叫“獨立組”設(shè)計)將其分為3組(每組的樣本量為5),①RAMP1過表達(dá)組:將所構(gòu)建的RAMP1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞并篩選出穩(wěn)定

8、表達(dá)的單克隆,待后續(xù)實驗使用;②空載體組:將pcDNA3.1(+)空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞并篩選出穩(wěn)定表達(dá)的單克隆,待后續(xù)實驗使用;③空白對照組:不轉(zhuǎn)染目的基因,相同實驗條件下培養(yǎng)。
　　3.RAMP1對MG-63細(xì)胞膜CRLR的調(diào)控作用:
　　3.1RAMP1真核表達(dá)載體的構(gòu)建:在美國國立生物技術(shù)信息中心(NationalCenterofBiotechnologyInformation,NCBI)上查找實驗所需人RAMP1的基因序列

9、,根據(jù)所查序列和實驗需要設(shè)計RAMP1基因開放閱讀框(openreadingframe,ORF)PCR引物,用總RNA提取試劑盒提取MG-63細(xì)胞總RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶的作用合成目的cDNA,將cDNA和pcDNA3.1(+)載體分別用BamHI-HindIII雙酶切并連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α擴增,為了驗證RAMP1目的基因序列是否有突變,將含有重組子的菌液送華大基因測序,選取無突變的單克隆菌液保種,經(jīng)測序正確后提取質(zhì)粒,并檢測所提取

10、質(zhì)粒濃度。
　　3.2轉(zhuǎn)染細(xì)胞并篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系:將所培養(yǎng)的細(xì)胞以5000個/孔的密度接種于96孔板,用不同濃度的G418培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,以10~14d殺死全部細(xì)胞的濃度為基本濃度,并以此確定篩選濃度和維持濃度。轉(zhuǎn)染前一天按106個/孔的密度將所培養(yǎng)細(xì)胞接種于6孔板,按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的標(biāo)準(zhǔn)程序轉(zhuǎn)染細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48h后用含G418的培養(yǎng)基按600mg/L的濃度篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞,2周后以250mg/L的濃度維持篩選壓力,挑選并在96孔板

11、中培養(yǎng)成陽性單克隆,擴大培養(yǎng)將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。用共聚焦顯微鏡觀察RAMP1及CRLR在MG-63細(xì)胞膜上的分布及表達(dá)情況;利用蛋白質(zhì)印跡法分別檢測3組細(xì)胞RAMP1和CRLR的蛋白表達(dá)水平;用實時PCR檢測3組細(xì)胞RAMP1和CRLR的mRNA表達(dá)情況。
　　4.CGRP對MG-63細(xì)胞增殖和分化的作用:
　　4.1增殖:CCK-8法檢測在0、24、48、72、96h時RAMP1過表達(dá)組/空載體組/空白對照組細(xì)胞

12、的增殖情況;使用流式細(xì)胞儀分別在0、8、16、24h時分別收集RAMP1過表達(dá)組/空載體組/空白對照組細(xì)胞并分析其細(xì)胞周期。
　　4.2分化:ALP染色定性檢測RAMP1過表達(dá)后CGRP對MG-63細(xì)胞ALP表達(dá)的作用;茜素紅染色定性檢測RAMP1過表達(dá)后CGRP對MG-63鈣化結(jié)節(jié)作用;Realtime-PCR定量檢測RAMP1過表達(dá)后CGRP對MG-63CollagenⅠmRNA表達(dá)的影響;ELISA定量檢測CGRP對MG-6

13、3堿性磷酸酶和OC的表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.RAMP1真核表達(dá)載體構(gòu)建:RAMP1基因的基因開放閱讀框(openreadingframe,0RF)克隆進(jìn)pcDNA3.1(+)載體,經(jīng)BamHI-HindIII雙酶切后瓊脂糖電泳可見相對分子質(zhì)量為467bp的條帶,經(jīng)測序鑒定堿基對無突變,表明成功構(gòu)建了pcDNA3.1(+)-RAMP1真核表達(dá)載體。
　　2.G418篩選及RAMP1過表達(dá)檢測:G418培養(yǎng)液遞增

14、篩選2周后未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞全部死亡,維持篩選25d后形成陽性克隆。
　　Western-blot和ImageJ灰度掃描分析結(jié)果顯示,RAMP1過表達(dá)組、空載體組、空白對照組RAMP1蛋白灰度值分別為43.57±1.50、30.26±1.51、26.77±2.73,表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MG-63細(xì)胞的RAMP1蛋白表達(dá)顯著高于其他兩組(P=0.013,P<0.05)。Realtime-PCR結(jié)果顯示,RAMP1過表達(dá)組、空載體組、空白對照

15、組的RAMP1mRNA的相對表達(dá)量分別為9.351±2.062、1.457±0.298、1.218±0.224,表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MG-63細(xì)胞的RAMP1mRNA的表達(dá)也顯著增加,與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=336.892,P=0.000,P<0.01),與空載體組相比差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(F=304.772,P=0.000,P<0.01),可認(rèn)為重組載體在細(xì)胞內(nèi)已有較高轉(zhuǎn)錄水平。
　　3.RAMP1過表達(dá)對MG-63細(xì)胞膜

16、上CRLR的影響:Western-blot和ImageJ灰度掃描分析結(jié)果顯示,RAMP1過表達(dá)組、空載體組、空白對照組CRLR蛋白灰度值分別為45.08±2.42、30.16±2.05、26.45±1.16,RAMP1過表達(dá)組的CRLR蛋白表達(dá)顯著高于其他兩組(P=0.011,P<0.05)。Realtime-PCR結(jié)果顯示,RAMP1過表達(dá)組、空載體組、空白對照組的CRLRmRNA的相對表達(dá)量分別為5.281±1.337、1.342±

17、0.264和1.277±0.282,表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MG-63細(xì)胞的CRLRmRNA的表達(dá)也顯著增加,與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=178.109,P=0.000,P<0.01),與空載體組相比差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(F=166.537,P=0.000,P<0.01)。免疫熒光染色結(jié)果顯示,RAMP1過表達(dá)組的CRLR的紅色熒光亮度明顯高于其他兩組,表明CRLR蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)高于其他兩個組。
　　4.CGRP對MG-63細(xì)

18、胞增殖和分化的作用:
　　4.1增殖:RAMP1過表達(dá)組的A值分別為0.390±0.016、0.628±0.175、0.896±0.592、1.055±0.004、1.179±0.618,均顯著高于相同時間點其他兩組A值(P<0.05),在72h時,較空白對照組(0.786±0.048)差距最明顯。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,RAMP1過表達(dá)組S期百分率分別為(1.25±0.13)%、(68.79±0.56)%、(64.49±1.59

19、)%、(57.82±0.75)%,均顯著高于其他兩組(P<0.01),在8h時,較空白對照組[(41.24±1.77)%]差距最明顯。
　　4.2分化:相同濃度CGRP(10–8mol/L)作用下RAMP1過表達(dá)組細(xì)胞ALP染色光密度值高于對照組(P<0.05或P<0.01);相同濃度CGRP(10–8mol/L)作用下RAMP1過表達(dá)組細(xì)胞茜素紅染色計數(shù)高于對照組(P<0.01);相同濃度CGRP(10–8mol/L)作用下RA

20、MP1過表達(dá)組細(xì)胞CollagenⅠmRNA的表達(dá)高于對照組(P<0.05或P<0.01);相同濃度CGRP(10–8mol/L)作用下RAMP1過表達(dá)組細(xì)胞ALP的表達(dá)高于對照組(P<0.05或P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.RAMP1過表達(dá)能夠促進(jìn)CRLR蛋白在MG-63細(xì)胞膜上的表達(dá)并可能增強其從胞內(nèi)向胞膜上的轉(zhuǎn)運,使CRLR在MG-63細(xì)胞膜上的分布增加,增加細(xì)胞膜上CGRP受體的直接結(jié)合位點。
　　2.

21、RAMP1過表達(dá)能增強CGRP對MG-63細(xì)胞促增殖作用,CCK-8法檢測結(jié)果顯示,在0、24、48、72、96h時RAMP1組的A值均顯著高于其他兩組(P<0.05),在72h時最顯著。RAMP1過表達(dá)組與其他兩組相比細(xì)胞S期百分率明顯增加,在8h時RAMP1過表達(dá)組與其他兩組S期百分率的差距最大,與相同時間點空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=603.18,P<0.01)。
　　3.RAMP1過表達(dá)能增強CGRP對MG-63細(xì)