通心絡(luò)聯(lián)合阿托伐他汀、阿司匹林(ATS)對ApoE---小鼠動脈粥樣硬化早期干預(yù)及機(jī)制研究.pdf

1、目的:動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是多種心腦血管事件的主要病理基礎(chǔ)，涉及脂質(zhì)代謝紊亂、內(nèi)皮功能損傷、凝血機(jī)制紊亂等。因此針對AS多因素參與的復(fù)雜病理過程，提出聯(lián)合用藥干預(yù)的治療策略—阿托伐他汀+通心絡(luò)+阿司匹林聯(lián)用“金三角”方案（ATS方案）。本研究采用高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠復(fù)制AS模型，探討ATS方案在防治AS中的作用，揭示三種藥物聯(lián)合應(yīng)用時的療效優(yōu)勢及作用機(jī)制，從而為缺血性心腦血管病的臨床防治提供優(yōu)選

2、方案。
　　 方法:
　　 1、高脂致ApoE-/-小鼠AS血管形態(tài)、血脂改變及ATS干預(yù)作用
　　 140只ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為:
　　 ①模型組;
　　 ②阿托伐他汀組(ATO);
　　 ③阿司匹林組(ASP);
　　 ④通心絡(luò)組(TXL);
　　 ⑤ATO+ASP組(A+A);
　　 ⑥ATS低劑量組(ATS-L);
　　 ⑦ATS高劑量組(AT

3、S-H)。
　　 每組20只，高脂飼料喂養(yǎng)同時灌胃給藥;另選同系C57BL/6J小鼠作為正常對照組，給予普通飼料;12周后禁食12h，眼底靜脈叢取血，分離血清，酶比色法檢測血清TC、TG、HDL、LDL水平;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清COX-1水平;應(yīng)用光鏡和透射電鏡觀察主動脈病理形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)變化;油紅O染色觀察主動脈粥樣硬化程度及斑塊內(nèi)脂質(zhì)沉積。
　　 2、ATS對ApoE-/-小鼠內(nèi)皮功能的影響
　

4、　 實(shí)驗造模、分組、給藥及取材方法同前，實(shí)驗?zāi)?，采用硝酸還原酶法檢測血清NO水平;羥胺法測定血清SOD活力;ELISA法檢測血清hs-CRP、ox-LDL;免疫組化方法檢測主動脈ET-1及巨噬細(xì)胞(Mac-3)陽性表達(dá);Western blot檢測主動脈COX-2、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、GM-CSF蛋白的表達(dá)。
　　 3、ATS對ApoE-/-小鼠AS主動脈NF-κB信號通路的影響
　　 實(shí)驗造模、分

5、組、給藥及取材方法同前，實(shí)驗?zāi)琖estern blot檢測小鼠主動脈組織IκKβ、IκBa、p-IκBa及NF-κ Bp65的蛋白表達(dá)水平;實(shí)時定量PCR(RT-PCR)檢測小鼠主動脈IκKβ、IκBa、NF-κBp65的mRNA表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、高脂致ApoE-/-小鼠血管形態(tài)、血脂改變及ATS干預(yù)作用
　　 1.1、主動脈形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)觀察:模型組內(nèi)皮下及中膜大量泡沫細(xì)胞堆積，管壁增厚，斑

6、塊形成明顯;電鏡顯示內(nèi)皮細(xì)胞脫落，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡化，胞間連接破壞，內(nèi)皮下間隙增寬，中膜平滑肌胞漿內(nèi)可見大量的脂滴和膽固醇結(jié)晶。各用藥組上述病理損傷均可見不同程度的減輕，其中ATS-H組病損明顯減輕，泡沫細(xì)胞數(shù)量明顯減少，斑塊明顯消退，內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)明顯改善，優(yōu)于模型組及其他用藥組。
　　 1.2、主動脈油紅O染色結(jié)果:模型組主動脈彈性較差，肉眼可見大量紅色斑點(diǎn)狀大小不等斑塊，斑塊穩(wěn)定性差易脫落，光鏡下可見大量紅色中

7、性脂滴存在。各用藥組主動脈紅色點(diǎn)狀斑塊均有不同程度的減少且穩(wěn)定性較好，斑塊內(nèi)紅色脂滴減少，其中ATS-H組主動脈紅色點(diǎn)狀斑塊明顯減少，斑塊穩(wěn)定不易脫落，斑塊內(nèi)紅色脂滴明顯減少，優(yōu)于模型組及其他用藥組。
　　 1.3、血脂測定結(jié)果:與正常組比較，模型組血清CHO、TG、LDL水平均明顯升高(P＜0.01)，HDL水平明顯降低(P＜0.01)。與模型組比較，除ASP組外，TXL、ATO組血清CHO、TG、LDL水平均明顯降低(P＜0

8、.01)，HDL均明顯升高(P＜0.01，P＜0.05)，兩組間血清CHO、TG、LDL、HDL水平均無顯著差異(P＞0.05); ATS兩劑量組血清CHO、TG、LDL均明顯低于單用ATO、TXL及A+A組(P＜0.05或P＜0.01)，HDL均明顯高于單用ATO、TXL及A+A組(P＜0.05或P＜0.01)，且ATS-H組血清CHO、LDL水平明顯低于ATS-L組(P＜0.05)，HDL水平明顯高于ATS-L組（P＜0.05）。<

9、br>　　 1.4、血清COX-1測定結(jié)果:與正常組比較，模型組血清COX-1水平明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較，除ATO組外，TXL、ASP組血清COX-1水平均明顯降低(P＜0.01)，兩組間比較無顯著性差異(P＞0.05);ATS兩劑量組血清COX-1水平均低于ASP、TXL及A+A組(P＜0.05，P＜0.01)，兩劑量組間比較無顯著性差異（P＞0.05）。
　　 2、ATS對ApoE-/-小鼠內(nèi)皮功能的影響<

10、br>　　 2.1、血清NO測定結(jié)果:與正常組比較，模型組血清NO水平明顯降低(P＜0.01)。與模型組比較，除ASP組外，TXL、ATO組血清NO水平均明顯升高(P＜0.01，P＜0.05)，兩組間比較無顯著性差異（P＞0.05）;ATS兩劑量組血清NO水平均高于ATO、TXL及A+A組(P＜0.05或P＜0.01)，兩劑量組間比較無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 2.2、主動脈ET-1的陽性表達(dá):正常組主動脈內(nèi)皮細(xì)胞E

11、T-1微弱陽性染色。模型組內(nèi)皮可見強(qiáng)陽性染色，其余各層亦見微弱陽性染色。除ASP組外，其余各用藥組主動脈陽性表達(dá)的強(qiáng)度和范圍均有不同程度的降低。其中ATS兩劑量組陽性染色明顯弱于三藥單用及兩西藥聯(lián)用組。
　　 2.3、血清SOD、ox-LDL測定結(jié)果:與正常組比較，模型組血清SOD活性明顯降低(P＜0.01)，ox-LDL水平明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較，除ASP組外，TXL、ATO組血清SOD活性均明顯增強(qiáng)(P＜0.

12、01)、ox-LDL水平均明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)，兩組間無顯著性差異(P＞0.05);ATS兩劑量組在增強(qiáng)SOD活性、降低ox-LDL方面明顯優(yōu)于ATO、TXL及A+A組(P＜0.05，P＜0.01)，兩組間無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 2.4、血清hs-CRP測定結(jié)果:與正常組比較，模型組血清hs-CRP水平明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，TXL與ATO、ASP組血清hs-CRP水平均明顯降低(

13、P＜0.01或P＜0.05)，三組間比較無顯著性差異(P＞0.05);ATS-L與A+A組間比較無顯著性差異(P＞0.05)，血清hs-CRP水平均明顯低于三藥單用組（P＜0.05），但均高于ATS-H組(P＜0.05)。
　　 2.5、主動脈Mac-3的陽性表達(dá):正常組主動脈無斑塊形成，未見明顯Mac-3陽性表達(dá);模型組主動脈有明顯斑塊形成，斑塊內(nèi)Mac-3陽性細(xì)胞數(shù)量較多，且染色較深;各用藥組主動脈斑塊范圍和Mac-3陽性細(xì)

14、胞數(shù)量均有不同程度的減少，其中ATS兩劑量組Mac-3陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于三藥單用及兩西藥聯(lián)用組。
　　 2.6、主動脈炎性相關(guān)因子的蛋白表達(dá)結(jié)果:與正常組比較，模型組主動脈ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、COX-2、GM-CSF蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.01）;與模型組比較，TXL與ATO、ASP組上述蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)，三組間比較無顯著性差異(P＞0.05);ATS-L與A+A組間比

15、較無顯著性差異(P＞0.05)，上述蛋白表達(dá)水平均明顯低于三藥單用組(P＜0.01，P＜0.05)，但均高于ATS-H組(P＜0.05)。
　　 3、ATS對ApoE-/-小鼠主動脈NF-κB信號通路的影響
　　 3.1、主動脈IκKβ、IκBa、NF-κBp65的mRNA表達(dá)結(jié)果:與正常組比較，模型組主動脈IκKβ、NF-κBp65的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.01)，IκBαmRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.01);與

16、模型組比較，除ATO組IκKβ mRNA表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)外，其他各用藥組主動脈IκKβ、NF-κBp65的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)、IκBα mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01);其中ATS-H組IκKβ、NF-κ Bp65 mRNA表達(dá)明顯低于A+A及ATS-L組(P＜0.01，P＜0.05)，IKBα mRNA表達(dá)明顯高于A+A及ATS-L組(P＜0.01，P＜0.05)。

17、>　　 3.2、主動脈IκKβ、IκBα、p-Iκ Ba及NF-κBp65的蛋白表達(dá)結(jié)果:與正常組比較，模型組主動脈IκKβ、p-Iκ Ba、NF-κ Bp65的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.01)，IκBα蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.01)。與模型組比較，除ATO組1κ Kβ蛋白表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)外，其他各用藥組主動脈IκKβ、p-Iκβa、NF-κBp65的蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)、Iκβα蛋白表達(dá)明

18、顯上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01);其中ATS-H組主動脈IκKβ、p-Iκ Ba、NF-κ Bp65蛋白表達(dá)明顯低于A+A組及ATS-L組(P＜0.01，P＜0.05)，IKBα蛋白表達(dá)明顯高于A+A組及ATS-L組(P＜0.01，P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、ATS方案能夠增強(qiáng)調(diào)脂和抑制血小板聚集的作用，其抑制AS的療效優(yōu)于三藥單用及兩西藥聯(lián)用，在減少西藥用量的同時，發(fā)揮抗AS作用;
　　 2、