眼鏡蛇毒細胞毒素-白介素4受體單抗免疫毒素的制備及其抗胰腺癌作用.pdf

1、免疫毒素(Immuonotoxin，IT)是由能與腫瘤細胞表面受體或細胞表面靶抗原特異結(jié)合的單克隆抗體和對腫瘤細胞具有殺傷作用的毒素分子通過化學交聯(lián)構(gòu)建而成。 細胞毒素(Cytotoxin，CTX)是眼鏡蛇毒中一類重要的活性蛋白，約占蛇毒總蛋白量的40％，由60-63個氨基酸殘基組成，分子量在7000Da左右，國內(nèi)外許多報道都證實其具有很強的抗腫瘤作用。 白介素.4受體(IL4R)已被發(fā)現(xiàn)在胰腺癌細胞表面高表達，但是在正

2、常胰腺組織和人肺癌細胞H1299則不表達或者低表達，目前以IL4R作為靶點的免疫毒素研究已取得一系列令人鼓舞的結(jié)果。為探索細胞毒素是否能與抗IL-4R單克隆抗體(Monoclonal antibody of IL-4receptor,MAILAR)偶聯(lián)構(gòu)建成免疫毒素，以選擇性殺傷高表達IL-4R的胰腺癌細胞，本實驗擬從眼鏡蛇毒中分離出CTX，將CTX與MAILAR進行了偶聯(lián)，并觀察和比較偶聯(lián)物對胰腺導管上皮癌PANC-1細胞，原位胰腺癌

3、BXPC-3細胞和肺腺癌H1299細胞的作用，為尋找胰腺癌治療新方法提供實驗資料。 1.CTX的分離純化眼鏡蛇毒粗毒經(jīng)過SP-Sepharose FF陽離子交換色譜，獲得13個蛋白質(zhì)組分。其中組分XI使大鼠離體心臟標本收縮張力增加、幅度縮小、最后停于收縮期，呈現(xiàn)明顯的心臟毒性；同時對分別刺激大鼠膈肌和膈神經(jīng)引起的收縮均有抑制作用，呈現(xiàn)明顯的細胞毒性作用，鑒定為眼鏡蛇毒細胞毒素(CTX)組分。將XI組分過Sephasi 1 Pep

4、tide C18柱精細純化，經(jīng)SDS-PAGE(Tris-Tricine系統(tǒng))鑒定，CTX-XI呈均一蛋白區(qū)帶；分子量為7235Da左右。自動電位滴定法測定PLA2，活力為0，得到CTX純品暫命名為CTX-XI。 2.免疫毒素MAILAR-CTX偶聯(lián)物的制備將CTX和MAILAR用N-琥珀酰胺-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)法進行偶聯(lián)，構(gòu)建CTX和MAIL4R的偶聯(lián)物，偶聯(lián)物MAIL4R-CTX在SDS-PAGE中為一條

5、分子量大于100kD的單一條帶，還原后則可見為兩條帶；該偶聯(lián)物既能與抗眼鏡蛇毒血清產(chǎn)生較強的抗原一抗體反應，也能直接與羊抗小鼠的抗體產(chǎn)生反應：與該偶聯(lián)物共同孵育的人胰腺癌BXPC-3細胞被染成棕色，而不表達IL-4R的人肺腺癌H1299細胞未被染色，表明偶聯(lián)物與人胰腺癌BXPC-3細胞具有很好的結(jié)合性，而與人肺癌H1299細胞不結(jié)合。 3.CTX、MAILAR和MAILAR-CTX體外抗腫瘤活性采用MTT法觀察CTX、MAILA

6、R和CTX-MAILAR對體外培養(yǎng)的PANC-1細胞，BXPC-3細胞和H1299細胞增殖的抑制作用，并測定其半數(shù)抑制濃度(IC50)。CTX對PANC-1，BXPC-3和H1299細胞均有快速的殺傷作用，CTX濃度為8μg/ml時，對PANC-1，BXPC-3和H1299細胞4h殺傷率分別為89.8％、88.0％和89.3％，對3株細胞的殺傷強度沒有明顯的區(qū)別；MAILAR對上述細胞明顯無殺傷作用；MAILAR-CTX濃度為9.4μg