轉(zhuǎn)chi+rip雙價(jià)基因大豆的抗病性檢測及其中間試驗(yàn)研究.pdf

1、大豆(Glycine max L．)是世界上重要的糧食和油料作物，是植物蛋白質(zhì)的主要來源。真菌性病害是導(dǎo)致大豆品質(zhì)和產(chǎn)量下降的重要原因，其中大豆灰斑病、疫霉根腐病、霜霉病等最為嚴(yán)重，每年都會(huì)造成不同程度損失，在病害大流行年份可造成嚴(yán)重?fù)p失甚至絕產(chǎn)。 本研究以本研究室獲得的轉(zhuǎn)chi+rip雙價(jià)抗真菌病基因大豆株系G0431、G0433的T<,3>代植株為試材，在溫室條件下對(duì)其進(jìn)行了大豆疫霉根腐病和大豆灰斑病的抗病性檢測，并對(duì)其主要

2、的農(nóng)藝性狀進(jìn)行了調(diào)查與分析，T<,3>代植株收獲后形成T<,4>代植株種子。經(jīng)農(nóng)業(yè)部審批(農(nóng)基安辦字2006-T002)，對(duì)上述2個(gè)株系的T<,4>代植株在黑龍江省進(jìn)行了中間試驗(yàn)的環(huán)境安全評(píng)價(jià)，系統(tǒng)研究了轉(zhuǎn)基因大豆的遺傳穩(wěn)定性、農(nóng)藝性狀、環(huán)境適應(yīng)能力及生存競爭能力、外源基因表達(dá)及其功能性狀的有效性等，完成了轉(zhuǎn)基因大豆中間試驗(yàn)的全部研究內(nèi)容，為轉(zhuǎn)基因大豆的中間試驗(yàn)的環(huán)境安全作出了科學(xué)評(píng)價(jià)，也為轉(zhuǎn)基因大豆的環(huán)境釋放和生產(chǎn)性試驗(yàn)的環(huán)境安全性評(píng)

3、價(jià)提供了重要理論依據(jù)。本研究的主要研究結(jié)果如下： 1．轉(zhuǎn)chi+rip雙價(jià)基因大豆T<,3>代植株的抗病性檢測與農(nóng)藝性狀調(diào)查 (1).株系G0431和G0433的T<,3>代植株的分子生物學(xué)檢測對(duì)株系G0431和G0433的T<,3>代植株進(jìn)行了PCR及real-time PCR檢測，PCR檢測結(jié)果表明，株系G0431和G0433的T<,3>代植株均能同時(shí)擴(kuò)增出2個(gè)外源目的基因：Real-time PCR檢測表明，2個(gè)外

4、源目的基因在轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA中的起始濃度均為其在未轉(zhuǎn)化植株中的約2<'15>倍，證明轉(zhuǎn)基因大豆T<,3>代植株中同時(shí)含有2個(gè)外源目的基因。 (2).株系G0431和G0433的T<,3>代植株中外源基因表達(dá)的檢測以G0431和G0433的T<,3>代植株的cDNA為模板為模板，以未轉(zhuǎn)化株cDNA為陰性對(duì)照，無菌水代替模板cDNA為負(fù)對(duì)照進(jìn)行real-time PCR檢測。結(jié)果表明，2個(gè)外源目的基因在G0431和G0433的

5、T<,3>代植株cDNA中的起始濃度分別為其在未轉(zhuǎn)化植株中的約2<'11>和2<'15>倍，證明2個(gè)外源基因在轉(zhuǎn)基因大豆植株中均同時(shí)進(jìn)行表達(dá)。 (3).株系G0431和G0433的T<,3>代植株的抗病性檢測對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆株系G0431和G0433的T<,3>代植株進(jìn)行了大豆疫霉根腐病和大豆灰斑病的抗性檢測，結(jié)果表明，2個(gè)株系對(duì)大豆疫霉根腐病的抗病性均由原來的高感提高到高抗，對(duì)大豆灰斑病的抗病性由原來的中抗提高到高抗水平。

6、 (4).株系G0431和G0433的T<,3>代植株主要農(nóng)藝性狀的調(diào)查與分析對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆主要的產(chǎn)量性狀、形態(tài)性狀以及品質(zhì)性狀進(jìn)行了調(diào)查與分析，結(jié)果表明，在產(chǎn)量性狀上，株系G0431和G0433與對(duì)照相比均無明顯差異；在形態(tài)性狀上，株系G0431結(jié)莢習(xí)性由亞有限結(jié)莢習(xí)性變成了無限結(jié)莢習(xí)性，株系G0433株高低于對(duì)照、生育期短于對(duì)照、結(jié)莢習(xí)性由亞有限結(jié)莢習(xí)性變成了無限結(jié)英習(xí)性；在品質(zhì)性狀上，與對(duì)照相比，2個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆株系蛋白含量有所下降而

7、油分含量有所上升，達(dá)到顯著水平。 2．轉(zhuǎn)chi+tip雙價(jià)基因大豆T<,4>代植株中間試驗(yàn)的環(huán)境安全評(píng)價(jià) (1).轉(zhuǎn)基因大豆的遺傳穩(wěn)定性對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆株系G0431和G0433的T<,4>代植株進(jìn)行了real-time PCR檢測，結(jié)果表明，2個(gè)外源基因在轉(zhuǎn)基因大豆中的起始濃度分別為其在未轉(zhuǎn)化植株中起始濃度的約2<'15>倍，充分證明轉(zhuǎn)基因大豆T<,4>代植株中同時(shí)含有2個(gè)外源基因，外源基因已穩(wěn)定遺傳至T<,4>代。

8、 (2).轉(zhuǎn)基因大豆的農(nóng)藝性狀對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆T<,4>代植株主要的產(chǎn)量性狀、形態(tài)性狀以及品質(zhì)性狀進(jìn)行了調(diào)查與分析，在產(chǎn)量性狀上，2個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆株系與對(duì)照相比均無明顯差異；在形態(tài)性狀上，株系G0431結(jié)莢習(xí)性由亞有限結(jié)莢習(xí)性變成了無限結(jié)莢習(xí)性，株系G0433株高低于對(duì)照、生育期短于對(duì)照、結(jié)莢習(xí)性由亞有限結(jié)莢習(xí)性變成了無限結(jié)莢習(xí)性；在品質(zhì)性狀上，與對(duì)照相比，2個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆株系蛋白含量有所下降而油分含量有所上升，達(dá)到顯著水平。 (3)

9、.轉(zhuǎn)基因大豆的生存競爭能力與環(huán)境適應(yīng)能力 ①.競爭性無論是在大豆適宜生長季節(jié)還是非適宜生長季節(jié)，在各種播種條件下，2個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆株系與對(duì)照在田間雜草種類、數(shù)目及覆蓋度方面均無明顯差別；2個(gè)株系轉(zhuǎn)基因大豆的覆蓋度均低于對(duì)照，達(dá)到5％顯著水平;2個(gè)株系轉(zhuǎn)基因大豆的出苗率與成苗率低于對(duì)照，達(dá)到5％顯著水平；在株高方面，株系G0431與對(duì)照相比無差別，株系G0433顯著低于對(duì)照，達(dá)到5％顯著水平。 ②.自生苗產(chǎn)生率轉(zhuǎn)基因大豆與對(duì)

10、照的自生苗產(chǎn)生率均為0，無明顯差別。 ③.繁育系數(shù) 株系G0431與對(duì)照相比，在始花期、盛花期、成熟期及單株粒數(shù)與對(duì)照相比無明顯差異，在單株粒數(shù)方面與對(duì)照相比無明顯差異;株系G0433與對(duì)照相比，在始花期、盛花期、成熟期均明顯早于對(duì)照，達(dá)到1％顯著水平；在單株粒數(shù)方面與對(duì)照相比無明顯差異。 ④.種子落粒性 在大豆適合生長季節(jié)播種，轉(zhuǎn)基因大豆與對(duì)照在種子落粒性方面無明顯差別，在大豆非生長季節(jié)播種由于大豆不能

11、正常成熟不能進(jìn)行種子落粒性實(shí)驗(yàn)。 ⑤.種子的自然延續(xù)能力無論是地表處理還是地下20cm處理，轉(zhuǎn)基因大豆與對(duì)照相比，在正常幼苗、不正常幼苗、未發(fā)芽種子和新鮮不發(fā)芽種子方面均無明顯差異，轉(zhuǎn)基因大豆與對(duì)照的種子延續(xù)能力相同。 (4).轉(zhuǎn)基因大豆中外源基因表達(dá)及其功能性狀的有效性對(duì)株系G0431和G0433的T<,4>代植株中2個(gè)基因進(jìn)行了real-time PCR檢測，結(jié)果表明2個(gè)外源基因均進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄表達(dá)；對(duì)株系G0431和G