全反式維甲酸對(duì)哮喘大鼠MMP-9-TIMP-1平衡及TGF-β1的作用.pdf

1、目的:觀察全反式維甲酸對(duì)哮喘大鼠MMP-9/TIMP-1平衡及TGF-β1的作用。在哮喘的發(fā)病過(guò)程中，多種細(xì)胞組分及細(xì)胞因子參與其中，而MMP-9/TIMP-1及TGF-β1在調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)生成與降解、氣道纖維化、氣道血管重塑等方面均發(fā)揮重要作用，故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定肺組織中MMP-9、TIMP-1及TGF-β1水平，并用來(lái)反映氣道重塑，探討全反式維甲酸對(duì)支氣管哮喘氣道重塑的作用及其可能作用機(jī)制，為臨床治療哮喘尋找新的藥物途徑。
　　

2、方法:30只6周齡清潔級(jí)SD雄性大鼠，體重在100-120g之間，隨機(jī)分成正常對(duì)照組、哮喘模型組、ATRA干預(yù)組，每組10只。哮喘模型組和ATRA干預(yù)組大鼠分別于實(shí)驗(yàn)第1、8天通過(guò)腹腔注射OVA100mg和氫氧化鋁100mg（混于0.9％氯化鈉溶液中）2ml進(jìn)行致敏。第15天起將大鼠置于自制的非完全密閉的簡(jiǎn)易霧化箱中吸入OVA溶液進(jìn)行激發(fā)試驗(yàn)，每次30分鐘，隔日一次，共20次。OVA溶液濃度由1％、1.5％、2％、2.5％、3％依次遞增

3、，每4次后遞增一次劑量。對(duì)照組以等量生理鹽水替代OVA，方法同上。ATRA干預(yù)組在每次激發(fā)前30分鐘給予劑量為20mg/kg ATRA生理鹽水混懸液灌胃給藥。在末次激發(fā)24小時(shí)后應(yīng)用1％戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉、處死大鼠，取各組大鼠BALF、血清及肺組織。測(cè)定BALF中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的數(shù)量，ELISA法檢測(cè)血清中TGF-β1濃度，部分肺組織免疫組化定性分析MMP-9、TIMP-1水平，部分肺組織行蘇木精—伊紅染色

4、，肺組織病理切片顯微鏡下放大200倍，應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件測(cè)定支氣管管壁厚度（管壁面積/管壁內(nèi)周長(zhǎng)）、支氣管平滑肌厚度。應(yīng)用圖像分析軟件測(cè)定MMP-9、TIMP-1的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。
　　結(jié)果:
　　1.哮喘模型的觀察:
　　通過(guò)腹腔注射OVA致敏及反復(fù)霧化吸入激發(fā)的方式成功建立大鼠哮喘模型，于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可見(jiàn)哮喘大鼠煩躁不安、呼吸急促、口唇發(fā)紺、腹式呼吸、腹肌痙攣、站立不穩(wěn)等表現(xiàn)。
　　2.肺泡灌洗液(BALF)

5、細(xì)胞計(jì)數(shù)（106幾）及分類結(jié)果:
　　哮喘組BALF中細(xì)胞總數(shù)(33.91±3.67)高于ATRA組(12.88±2.72)，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);且兩組均高于正常對(duì)照組（9.68±2.71），存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=183.370，P＜0.01)。
　　哮喘組BALF中嗜酸性粒細(xì)胞(5.38±0.63)高于ATRA組(2.19±0.53)，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);且兩組均高于正常對(duì)照組（1.17±0.48），

6、存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=160.003，P＜0.01)。
　　哮喘組BALF中中性粒細(xì)胞（1.14±0.20）高于ATRA組（0.65±0.18），存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);且兩組均高于正常對(duì)照組(0.28±0.12)，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=63.937，P＜0.01)。
　　哮喘組BALF中的淋巴細(xì)胞(2.99±0.53)高于ATRA組(2.28±0.49)，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);且兩組均高于正常對(duì)照組(1.27

7、±0.36)，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.568，P＜0.01)。
　　3.病理圖像分析結(jié)果:
　　哮喘組大鼠氣道壁厚度及平滑肌厚度分別為98.78±2.86、45.49±2.40，明顯高于正常對(duì)照組70.87±1.80、17.68±1.14(P＜0.01，P＜0.01);ATRA組分別為86.20±2.36、33.53±1.36較哮喘組有所降低，但仍高于正常對(duì)照組(P＜0.01)，三組之間存在顯著性差異(F=345.002，

8、P＜0.01;F=345.002，P＜0.01)。
　　4.免疫組化法測(cè)定MMP-9、TIMP-1及二者比值結(jié)果:
　　MMP-9:哮喘組(0.63±0.02)明顯高于正常對(duì)照組(0.22±0.01)(P＜0.01)，ATRA組（0.41±0.02）較哮喘組明顯降低但仍高于正常對(duì)照組（0.22±0.01），三組之間存在顯著性差異(F=1391.446，P＜0.01)。
　　TIMP-1:哮喘組（0.77±0.03）明顯

9、高于正常對(duì)照組（0.21±0.02）(P＜0.01)，ATRA組（0.44±0.03）較哮喘組明顯降低但仍高于正常對(duì)照組(0.21±0.02)，三組之間存在顯著性差異(F=1326.128，P＜0.01)。
　　MMP-9/TIMP-1:哮喘組（0.82±0.01）明顯低于正常對(duì)照組(1.05±0.02)(P＜0.01)，ATRA組（0.92±0.01）較哮喘組有所升高，但仍低于正常對(duì)照組（1.05±0.02），三組之間存在顯著性

10、差異(F=527.533，P＜0.01)。
　　5.ELISA法檢測(cè)血清中TGF-β1含量(ng/ml):
　　哮喘組(28.50±3.72)明顯高于正常對(duì)照組（12.87±1.82）(P＜0.01)，ATRA組（19.18±3.65）明顯低于哮喘組但仍高于正常對(duì)照組（12.87±1.82）(P＜0.01)，三組之間存在顯著性差異(F=60.763，P＜0.01)。
　　6.相關(guān)性分析結(jié)果:
　　結(jié)果表明MMP-

11、9與TIMP-1(r=0.999，P＜0.01)呈顯著正相關(guān)，與TGF-β1（r=0.887，P＜0.01）顯著正相關(guān)，與氣道壁厚度顯著正相關(guān)(r=0.990，P＜0.01);TIMP-1與氣道壁厚度顯著正相關(guān)(r=0.984，P＜0.01);MMP-9/TIMP-1二者比值與氣道壁厚度顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.993，P＜0.01);TGF-β1與平滑肌厚度顯著正相關(guān)（r=0.876，P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.哮喘

12、組大鼠氣道周圍明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔內(nèi)充填大量炎性滲出物，病理圖像分析系統(tǒng)顯示哮喘組大鼠存在明顯氣道重塑，說(shuō)明建模成功;應(yīng)用ATRA干預(yù)后這種炎癥改變明顯減輕，說(shuō)明ATRA具有一定抗炎作用。
　　2.MMP-9、TIMP-1、TGF-β1水平及氣道壁厚度四者之間互為正相關(guān)，參與氣道重塑。
　　3.ATRA具有下調(diào)TGF-β1、MMP-9、TIMP-1的表達(dá)，協(xié)調(diào)MMP-9/TIMP-1平衡的作用，減緩氣道重塑，提示ATRA具