基于TGFβ1-Smad3通路全反式維甲酸治療TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠的作用研究.pdf

1、目的：炎癥性腸病是一種目前病因仍不清楚的疾病，其中免疫炎癥-抗免疫炎癥反應(yīng)的失調(diào)，被認(rèn)為是一種重要的發(fā)病機(jī)制。全反式維甲酸具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，已用于許多免疫性皮膚病等的治療，本文探討全反式維甲酸對(duì)炎癥性腸病大鼠模型有無(wú)治療作用及可能的作用機(jī)制，為治療IBD提供一種可供選擇的方法。
　　方法：成功復(fù)制大鼠TNBS結(jié)腸炎模型后，實(shí)驗(yàn)分為5組，分別為空白組，造模組（TNBS組），全反式維甲酸組（A組）、美沙拉嗪組（M組）、全反式維甲

2、酸+美沙拉嗪（MA組），各組給予不同的藥物灌胃一周，在給藥的每天觀察各組大鼠的基本情況：包括觀察糞便形態(tài)，立毛、進(jìn)食、活動(dòng)、監(jiān)測(cè)體重變化等，行相應(yīng)的DAI積分，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，肉眼觀察各組大鼠的結(jié)腸大體觀（如有無(wú)潰瘍、潰瘍大小等，與周圍組織的粘連情況；腸壁活動(dòng)度如何，是否僵硬等），取各組的結(jié)腸組織制作切片，觀察各組的病理學(xué)變化情況。使用QT-PCR檢測(cè)TGF-β1 mRNA，Smad7 mRNA的表達(dá)情況，最后采取免疫組織化學(xué)測(cè)定積分光密度

3、值的辦法，測(cè)定組織中Smad7蛋白及磷酸化Smad3(pSmad3)。最后用ELISA法檢測(cè)IL-17、TNF-α的水平。明確全反式維甲酸是否可以通過(guò)對(duì)該通路的影響來(lái)發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)的作用。
　　結(jié)果：
　　1、造模24小時(shí)后，在給予藥物干預(yù)前，首次行DAI積分，結(jié)果顯示：與空白組比較，模型及各治療組DAI（大鼠的一般情況評(píng)分）評(píng)分均升高，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明結(jié)腸炎模型被成功復(fù)制，除空白組外，其余各組間DAI積分無(wú)明顯差異，

4、提示造模形成的結(jié)腸炎癥嚴(yán)重程度較一致；此外，經(jīng)給予不同的藥物灌胃處理后，與TNBS組相比較，各藥物干預(yù)組的DAI及TDI評(píng)分（大鼠的結(jié)腸病理組織評(píng)分）以及結(jié)腸大體觀較TNBS組均不同程度改善，差異顯著（P<0.05），提示上述這幾種不同的處理措施均對(duì)結(jié)腸炎大鼠起到緩解作用；在這其中，全反式維甲酸組與美沙拉嗪組這幾項(xiàng)評(píng)分差異無(wú)顯著性；全反式維甲酸+美沙拉嗪組的DAI、TDI、結(jié)腸外觀較A組、M組組下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）

5、，提示聯(lián)合用藥效果較單一用藥效果更優(yōu)。
　　2、而利用Q-PCR檢測(cè)mRNA水平提示：TGF-β1在空白組中最低，而在模型組中有所升高，表明增高的TGF-β1并未正常發(fā)揮其免疫抑制作用；在經(jīng)過(guò)不同藥物干預(yù)后，各治療組較TNBS組均有不同程度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示藥物可能可以通過(guò)TGF-β1/Smad3通路起作用；其中尤以聯(lián)合組升高得更明顯，差異明顯（p<0.05）。Smad7 mRNA在干預(yù)后，較TNBS組均

6、下降明顯：M組和A組間比較無(wú)明顯差異（P>0.05），聯(lián)合組下降最顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；
　　3.免疫組化檢測(cè)Smad7蛋白表達(dá)情況顯示在模型組最高，治療后均較TNBS組明顯降低（P<0.05），其中A組與M組下降水平不具有差異性（P=0.586）,但是MA組較A組或M組下降更為明顯，差異有顯著性（P<0.05）。而對(duì)于pSmad3而言，在TNBS組，顯微鏡下（40×）下僅能見(jiàn)到少許的淺黃染顆粒，MA組可見(jiàn)較多

7、被染成黃褐色的著色較深的細(xì)胞，但達(dá)不到空白組的水平。積分光密度顯示，pSmad3在TNBS組表達(dá)最少，相較于TNBS組，A組和M組表達(dá)量較高，差異有顯著性（P值為0.000，0.000），A組與M組差異無(wú)顯著性（p=0.397）,MA組升高最明顯（P<0.05）。
　　4.ELISA法檢測(cè) TNBS組及各治療組中大鼠血清中IL-17、TNF-α水平，采用單因素分析，各組間差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（其中IL-17的F值為85.94，P

8、=0.000，TNF-α的F值為74.13，P=0.000），兩類炎癥因子的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果均提示：M組與A組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05），MA組炎癥因子水平最低，所有治療組經(jīng)干預(yù)后仍較空白組高，明顯低于TNBS組。
　　結(jié)論：
　　1.炎癥性腸病中存在著TGFβ1/Smad3通路的受損，導(dǎo)致盡管結(jié)腸炎大鼠TGFβ1升高，但由于pSmad3大量減少而Smad7大量增加，該通路被阻斷，導(dǎo)致TGFβ1未能發(fā)揮其正常的免疫抑制作