Nec-1抑制缺血性腦中風(fēng)誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞necroptosis的信號機(jī)制.pdf

1、目的：觀察體內(nèi)體外缺血缺氧誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的壞死性凋亡，研究壞死性凋亡特異性阻斷劑Nec-1對小鼠局灶性缺血性腦損傷的保護(hù)作用及其保護(hù)缺血缺氧性星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的機(jī)制：抑制RIP1-Cathepsins信號機(jī)制的激活。
　　方法：采用小鼠永久性大腦中動脈阻塞（permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO)方法，建立腦缺血的小鼠模型。小鼠腦缺血前10min或缺血后6h側(cè)腦室注射N

2、ec-1，以腦梗塞體積、行為學(xué)癥狀等指標(biāo)評價 necroptosis特異性抑制劑 Nec-1對腦缺血的保護(hù)作用。采用原代培養(yǎng)的新生大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation,OGD)方法，建立腦缺血的細(xì)胞模型。LDH法檢測OGD誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞乳酸脫氫酶漏出率。利用透射電鏡檢測體內(nèi)缺血性腦中風(fēng)誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中的壞死性凋亡。Western Blot法檢測體內(nèi)體外缺血缺氧對星形膠質(zhì)細(xì)胞RIP1和

3、necroptosis相關(guān)蛋白的表達(dá)，以及Nec-1對RIP1和necroptosis相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：術(shù)前10min和術(shù)后6h給予Nec-1（24nmol）均可有效地減少pMCAO小鼠腦梗死體積(P<0.01)，改善其行為學(xué)癥狀(P<0.05)。透射電鏡顯示：小鼠中動脈阻塞12h可見小鼠大腦缺血皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)壞死的形態(tài)，Nec-1（24nmol）給藥組小鼠大腦缺血皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞壞死的狀態(tài)明顯得到好轉(zhuǎn)。Wes

4、tern Blot結(jié)果顯示：皮層缺血區(qū)RIP1-Cathepsins通路相關(guān)蛋白RIP1、Cathepsin B、Cathepsin L表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。給予Nec-1干預(yù)之后，可對抗皮層缺血區(qū)RIP1、Cathepsin B、Cathepsin L、LC3表達(dá)的上調(diào)。在大鼠新生鼠的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪的體外缺血模型，LDH結(jié)果顯示：Nec-1（1、10、100μM)劑量依賴性地

5、降低氧糖剝奪引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞乳酸脫氫酶漏出率(P<0.05，P<0.01)，顯著增加星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目(P<0.05，P<0.01)。Western Blot結(jié)果顯示：星形膠質(zhì)細(xì)胞在OGD后，RIP1-Cathepsins通路相關(guān)蛋白RIP1、Cathepsin B、Cathepsin L表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，Nec-1可對抗OGD引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞中RIP1、Cathepsin

6、B、Cathepsin L、LC3蛋白表達(dá)的變化。此外，Western Blot結(jié)果顯示：RIP1基因沉默能降低體內(nèi)體外自噬的水平以及Cathepsin B、Cathepsin L的表達(dá)。
　　結(jié)論：1.necroptosis特異性抑制劑Nec-1對小鼠局灶性腦缺血和OGD導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用。
　　2. necroptosis特異性抑制劑Nec-1對缺血性腦中風(fēng)誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)的保護(hù)作用通過抑制RIP1-