GDF11對大鼠缺血性腦中風(fēng)的防治及機制研究.pdf

1、研究背景
　　腦中風(fēng)是臨床最常見的疾病之一，具有發(fā)病率、致殘率和病死率高的特點，其中缺血性腦中風(fēng)占全部腦中風(fēng)的70％～80％。治療缺血性腦中風(fēng)常用的藥物有三大類，分別是通過促使血管再通復(fù)流的溶栓治療藥物、通過減少細胞損傷，改善腦血流的神經(jīng)保護劑，以及中草藥藥物治療。但是由于許多藥物存在著療效弱、副作用多等問題，尋找高效安全的治療藥物仍然任重道遠。
　　近年來人們采用小鼠聯(lián)體共生模型進行抗衰老和再生的研究，發(fā)現(xiàn)在年輕鼠血液中含

2、有可以“返老還童”的生長分化因子11(Growth differentiation factor11，GDF11):它可以改善因衰老而導(dǎo)致的機能下降例如肌肉萎縮、心力衰竭、反應(yīng)遲鈍、認知能力降低等，為衰老和再生醫(yī)學(xué)的研究帶來了新的曙光。GDF11是轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming growth factor beta，TGF-β）家族的成員。研究結(jié)果顯示血液中GDF11分子的表達隨著年紀的增加而降低，向老年小鼠體內(nèi)連續(xù)注入體外重

3、組的GDF11蛋白，使其含量恢復(fù)到年輕小鼠體內(nèi)相同的水平時，可以導(dǎo)致許多因衰老而出現(xiàn)的機能下降有所緩和甚至恢復(fù)到原先的水平，與年輕血液的作用基本一致。這些結(jié)果說明GDF11對體內(nèi)多種組織器官因衰老引起的功能下降具有明顯的改善作用。然而目前對于GDF11在衰老和再生的作用還存在著爭議，因為有研究發(fā)現(xiàn)將體外重組的GDF11蛋白注入老年小鼠體內(nèi)抑制了肌肉的再生，得到了相反的結(jié)果。
　　研究報道GDF11可以增強老年小鼠腦內(nèi)的血液循環(huán)，促

4、進室管膜下區(qū)(Subventricularzone，SVZ)神經(jīng)干細胞增殖進而使神經(jīng)元存活能力增強，說明GDF11對腦內(nèi)神經(jīng)再生具有促進的作用。另外有文獻證實，GDF11在腦缺血再灌注大鼠的皮層缺血半影區(qū)表達量顯著升高，猜測GDF11可能參與腦缺血再灌注引起的腦損傷的修復(fù)過程。在缺血性腦中風(fēng)后GDF11對腦缺血引起的損傷到底發(fā)揮什么作用？是正調(diào)控還是負調(diào)控？為了解決這些問題，本課題中我們用線栓法局灶性腦缺血再灌注大鼠模型為研究對象，運用

5、分子細胞生物學(xué)和動物行為學(xué)測試等方法來研究GDF11對腦缺血損傷的防治作用及機制。
　　研究目的
　　1、GDF11在腦缺血損傷治療中的作用及機制。
　　2、GDF11在腦缺血損傷預(yù)防中的作用及機制。
　　研究方法
　　1、建立線栓法局灶性腦缺血再灌注模型
　　使用栓線堵塞大鼠右側(cè)大腦中動脈造成大腦中動脈閉塞(Middle cerebralartery occlusion，MCAO)，2小時缺血之后拔

6、線進行血液再灌注。
　　2、腦立體定位微量注射
　　將大鼠用水合氯醛麻醉之后固定在腦立體定位儀上，充分暴露顱骨，以前囟點為零點，按照腦室坐標(biāo)進行打孔注射，腦室坐標(biāo):前后(AP)，-0.9mm;左右(L)，±1.5mm;背腹(V)，-3.6mm。
　　3、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine，BrdU)注射和免疫組織化學(xué)染色
　　大鼠在灌流取腦前2小時進行腹腔注射BrdU，取腦后將腦從

7、前向后切成40微米的薄片進行免疫組化染色。BrdU的一抗使用濃度1∶500，GDF11的一抗?jié)舛?∶1000，Caspase-3的一抗?jié)舛?∶500，Ki67一抗?jié)舛?∶100，Nestin一抗?jié)舛?∶500。
　　4、實時定量PCR
　　將腦組織取出，提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR Green熒光標(biāo)記法實時定量PCR技術(shù)，檢測GDF11和內(nèi)參β-actin的mRNA表達水平。
　　5、評估腦缺血體積

8、>　　取腦后將腦從前向后切成2毫米的腦片，將切好的腦片放在37℃氯化三苯基四氮唑(Triphenyltetrazolium chloride，TTC)溶液里，避光孵育30分鐘后，可觀察腦缺血范圍大小，最后使用Photoshop軟件計算腦缺血面積。
　　實驗結(jié)果
　　1、腦缺血后大鼠皮層缺血半影區(qū)GDF11的表達水平顯著上升
　　取成功建立腦缺血再灌注模型的大鼠和假手術(shù)大鼠各3只，24h后灌流取腦，用免疫組織化學(xué)的方法檢

9、測GDF11的表達，發(fā)現(xiàn)缺血側(cè)皮層半影區(qū)GDF11的表達要顯著高于假手術(shù)組。另取成功造模的大鼠分別再灌注2h、6h、12h、24h、48h后，取其皮層半影區(qū)，提取RNA做實時熒光定量PCR，發(fā)現(xiàn)6h后GDF11mRNA水平顯著上升，48h后恢復(fù)到正常水平。
　　2、GDF11在腦缺血損傷治療中的作用
　　2.1缺血后給予GDF11外源重組蛋白促使大鼠腦缺血體積下降
　　建立腦缺血再灌注大鼠模型，缺血2h再灌注24h后，

10、進行側(cè)腦室注射GDF11外源重組蛋白，3天后活體取腦進行TTC染色，發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組相比腦缺血體積顯著降低。
　　2.2缺血后給予GDF11外源重組蛋白促使大鼠神經(jīng)功能改善
　　建立腦缺血再灌注大鼠模型，缺血2h再灌注24h后，進行側(cè)腦室注射GDF11外源重組蛋白，3天后根據(jù)Longa及Bederson的5分制法進行評分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組相比神經(jīng)功能缺陷評分顯著下降。
　　3、GDF11在腦缺血損傷治療中的作用

11、機制
　　3.1缺血后給予GDF11外源重組蛋白顯著降低皮層缺血半影區(qū)的細胞凋亡
　　建立腦缺血再灌注大鼠模型，缺血2h再灌注24h后，進行側(cè)腦室注射GDF11外源重組蛋白，3天后灌流取腦進行免疫組織化學(xué)染色和TUNEL試劑盒染色，發(fā)現(xiàn)實驗組中皮層半影區(qū)凋亡細胞的數(shù)量顯著降低。
　　3.2缺血后給予GDF11外源重組蛋白使室管膜下區(qū)細胞增殖水平下降
　　對大鼠建立局灶性腦缺血再灌注模型，缺血2h再灌注24h后，進

12、行側(cè)腦室注射GDF11外源重組蛋白，3天后灌流取腦，通過增殖標(biāo)記物BrdU、Ki67進行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，大鼠腦內(nèi)GDF11水平升高后導(dǎo)致室管膜下區(qū)BrdU陽性細胞及Ki67陽性細胞數(shù)顯著降低。
　　3.3缺血后給予GDF11外源重組蛋白對室管膜下區(qū)周圍血管重構(gòu)無影響
　　為了觀察GDF11外源蛋白對室管膜下區(qū)周圍血管再生的影響，建立大鼠腦缺血再灌注模型，缺血2h再灌注24h后，進行側(cè)腦室注射GDF11外源重組蛋白，3天

13、后灌流取腦，通過血管再生標(biāo)記物CD31進行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，大鼠腦內(nèi)GDF11水平升高后導(dǎo)致室管膜下區(qū)周圍CD31陽性細胞數(shù)目無顯著變化。
　　4、GDF11在腦缺血損傷預(yù)防中的作用
　　4.1過表達GDF11預(yù)處理可減少大鼠腦缺血體積
　　對大鼠進行側(cè)腦室注射GDF11過表達病毒及陰性對照病毒，病毒表達12天后建立局灶性腦缺血再灌注模型，缺血2h再灌注3天后，活體取腦進行TTC染色，發(fā)現(xiàn)實驗組中腦缺血體積顯著降低

14、。
　　4.2過表達GDF11預(yù)處理可降低大鼠神經(jīng)功能缺陷
　　對大鼠進行側(cè)腦室注射GDF11過表達病毒及陰性對照病毒，病毒表達12天后建立局灶性腦缺血再灌注模型，缺血2h再灌注3天后，根據(jù)Longa及Bederson的5分制法進行評分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組中神經(jīng)功能缺陷評分顯著下降。
　　5、過表達GDF11對腦缺血損傷預(yù)防的作用機制
　　5.1過表達GDF11預(yù)處理顯著降低皮層缺血半影區(qū)的細胞凋亡
　　對大鼠

15、進行側(cè)腦室注射GDF11過表達病毒及陰性對照病毒，病毒表達12天后建立局灶性腦缺血再灌注模型，缺血2h再灌注3天后，灌流取腦進行免疫組織化學(xué)染色和TUNEL試劑盒染色，發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組相比，皮層缺血半影區(qū)的凋亡細胞受到了保護。
　　5.2過表達GDF11預(yù)處理可促使腦缺血再灌注模型大鼠SVZ腦區(qū)細胞增殖
　　向大鼠側(cè)腦室微量注射GDF11過表達慢病毒，病毒表達12天之后建立局灶性腦缺血再灌注模型，缺血2小時再灌注3天后對大

16、鼠進行腹腔注射BrdU，2小時后進行灌流取腦和免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GDF11使得MCAO大鼠SVZ腦區(qū)增殖標(biāo)記物BrdU陽性細胞數(shù)顯著上升。
　　5.3過表達GDF11預(yù)處理促進腦缺血再灌注模型大鼠SVZ腦區(qū)周圍血管再生
　　對大鼠進行側(cè)腦室注射GDF11過表達病毒及陰性對照病毒，病毒表達12天后建立局灶性腦缺血再灌注模型，缺血2h再灌注3天后，灌流取腦通過血管再生標(biāo)記物CD31進行免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，大鼠腦內(nèi)GDF11

17、過表達后導(dǎo)致室管膜下區(qū)周圍CD31陽性細胞數(shù)顯著增加。
　　6、GDF11通過調(diào)控Smad2/3信號通路參與腦缺血損傷的治療及預(yù)防作用
　　為了闡明GDF11參與腦缺血防治的分子機制，我們?nèi)》謩e注射了GDF11外源重組蛋白及注射了PBS的大鼠進行腦缺血再灌注模型的建立，缺血2h再灌注3天后對大鼠缺血半影區(qū)進行取材，通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)GDF11外源蛋白的處理使得pSmad2/3水平顯著升高。
　　同樣，

18、我們對大鼠注射GDF11過表達病毒及陰性對照病毒12天后建立腦缺血再灌注模型，缺血2h再灌注3天后對大鼠缺血半影區(qū)進行取材，通過Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)過表達GDF11預(yù)處理使得pSmad2/3水平顯著升高。總之，GDF11通過調(diào)控Smad2/3信號通路參與腦缺血的預(yù)防和治療。
　　實驗結(jié)論
　　1、腦缺血再灌注后，GDF11在皮層缺血半影區(qū)表達上調(diào)。
　　2、GDF11可以參與治療腦缺血再灌注所致的神經(jīng)損傷

19、，通過抑制半影區(qū)細胞凋亡的作用機制。
　　3、GDF11在腦缺血再灌注預(yù)防中發(fā)揮作用，可通過促進SVZ腦區(qū)細胞增殖，增強周圍血管的再生以及抑制半影區(qū)細胞凋亡方式，減少腦缺血再灌注造成的損傷。
　　4、GDF11在腦缺血防治中的作用是通過調(diào)控Smad2/3信號通路實現(xiàn)的。
　　創(chuàng)新點
　　1、GDF11對大鼠腦缺血再灌注所致的損傷具有預(yù)防和治療作用。
　　2、GDF11在預(yù)防和治療大鼠腦缺血再灌注損傷方面的作