生長抑素受體在肝癌細(xì)胞的表達(dá)及動物模型中的分子顯像研究.pdf

1、據(jù)報(bào)道，發(fā)達(dá)國家排在死亡率第一位的是心血管疾病，惡性腫瘤排在第二位；而在我們國家，惡性腫瘤的死亡率排在第一位，其中原發(fā)性肝癌(Primary LiverCarcinoma，PLc)的發(fā)病率在惡性腫瘤中居第三位，對其治療尚存在許多困難，較為有效的治療手段是手術(shù)切除。在可切除的原發(fā)性肝癌患者中五年生存率是40％左右，但是，由于手術(shù)適應(yīng)癥的限制以及腫瘤分期等因素的影響，能進(jìn)行手術(shù)切除的原發(fā)性肝癌不足25％(有文獻(xiàn)報(bào)道是10％左右)。對于大多數(shù)

2、原發(fā)性肝癌尤其是中晚期肝癌患者來說，主要的治療手段是保守治療，如放射治療、介入治療、激素治療、藥物治療等。在非手術(shù)的肝癌患者中，肝動脈介入栓塞化療(TACE)有可能使病人緩解、存活期延長，其1-3年生存率分別為51％、28％和13％。放射治療對于原發(fā)性肝癌治療的適應(yīng)癥較為廣泛，不受解剖部位的限制，也不受腫瘤是多個或彌漫病灶的限制，是治療原發(fā)性肝癌的重要手段之一。一般認(rèn)為，肝癌是放射不敏感的惡性腫瘤，根治劑量非常大(據(jù)估計(jì)要≥60Gy)。

3、這個劑量超過了正常肝組織的耐受量，況且多數(shù)臨床就診病人除了分期較晚往往多合并不同程度的肝硬化，給予大體積的高劑量放射易產(chǎn)生放射性肝炎。由于正常肝耐受量劑量的限制，肝癌的放射治療只能起到抑制腫瘤的姑息作用。因此，用玻璃微球?yàn)檩d體的內(nèi)放射治療曾風(fēng)行一時，試圖解決外放療劑量和保護(hù)正常肝組織的治療矛盾，經(jīng)過數(shù)年臨床實(shí)踐，發(fā)現(xiàn)由于放射性核素不是直接與癌細(xì)胞結(jié)合，核素不能“內(nèi)化”，在腫瘤組織中射線難以透射，所以這一治療方法仍存在放射劑量不足的問題，

4、同時還存在玻璃微球可能沉積到肺、腎等正常組織造成小動脈栓塞的缺陷，所以臨床應(yīng)用并不廣泛。非標(biāo)記奧曲肽(Octreotide)用于治療肝癌可以使試驗(yàn)動物腫瘤縮小，生存期延長首先由Nakaizumi A.和Schinded D.T.分別進(jìn)行的肝癌的誘癌和移植癌動物實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。1998年，Kouroumalis等首次在一臨床隨機(jī)試驗(yàn)中證明奧曲肽能明顯增加晚期不能切除的原發(fā)性肝癌患者的生存率(一年生存率56％)，使晚期肝癌患者的臨床癥狀改善、生

5、存期延長以及提高生存質(zhì)量。誠然，在原發(fā)性肝癌的早期可以提高患者治愈的可能性，真正做到“三早”，即：早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。但是，在我國肝癌發(fā)病率居高不下，當(dāng)然發(fā)生這種現(xiàn)象的因素很多，不過，筆者認(rèn)為缺乏有效、無創(chuàng)、方便、經(jīng)濟(jì)的診斷方法是一個非常重要的原因。因此，我們有必要發(fā)明一種有效的診斷、治療技術(shù)來為患者服務(wù)。生長抑素(Somatostatin，SS/SST)是一種具有廣泛生物活性的激素，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、腸道、胃及胰腺等組

6、織內(nèi)，在機(jī)體功能調(diào)節(jié)與某些疾病的發(fā)病機(jī)制中都發(fā)揮著重要作用。生長抑素也與其他激素的作用途徑一樣，是通過生長抑素受體(Somatostatin Receptors，SSTR)而發(fā)揮其生理及抗腫瘤作用的?，F(xiàn)已了解SSTR屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，介導(dǎo)著生長抑素的多種生物功能。SSTR定位于細(xì)胞膜，有七個跨膜區(qū)組成。SSTR由五個非等位基因編碼，位于五個不同的染色體，形成了由5種受體亞型組成的SSTR家族，即SSTR1-5。其中SSTR2又存在

7、SSTR2A與SSTR2B兩種變異體，目前對SSTR2B的功能尚不清楚。SST主要通過與細(xì)胞表面的SST受體(SSTR)結(jié)合，然后活化受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮其生物學(xué)作用。經(jīng)研究證實(shí)，人類SSTR，是一種G蛋白偶聯(lián)型受體，由7個跨膜糖蛋白組成。SSTR家族包括5個亞型，即SSTR-1～5.根據(jù)氨基酸序列同源性的高低和與此相關(guān)配體的選擇性及功能應(yīng)答的相似性，將SSTR家族分為兩大亞族：(1)SSTR-1、4；(2)SSTR-2、3、5。根據(jù)

8、細(xì)胞類型不同，這五種受體亞型通過GTP結(jié)合蛋白抑制腺苷酸環(huán)化酶活性，它們分別通過偶聯(lián)酪氨酸磷脂酶(SSTR1.2)、K+-Ca2+通道(SSTR2)、Na+-H+交換(sSTRl)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ErK1/2)、磷脂酶A2和MAP激酶(SSTR4)等不同的信號傳遞途徑影響細(xì)胞的增殖和生理活動。目前已人工合成數(shù)十種生長抑素類似物(sSA)，用得較多的為奧曲肽(Octreotide)和RC-160等幾種8肽SSA。其優(yōu)點(diǎn)是：較易合成、

9、Mr小(1000左右)、血中清除快、穿透力強(qiáng)、靶向性好以及在瘤內(nèi)保留時間長等。近年許多試驗(yàn)證實(shí)，放射標(biāo)記生長抑素類似物可以顯著抑制許多表達(dá)SSTR腫瘤(神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌和小細(xì)胞肺癌等)的生長，使腫瘤明顯縮小或消失。通過對實(shí)驗(yàn)性癌瘤的抑瘤生長研究表明，療效較好，但其仍存在腫瘤對標(biāo)記配體攝取量很低的問題，尤對體積較大的移植瘤更加突出。本實(shí)驗(yàn)旨在研究SSTR2在體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株HepG2中，采用免疫組化方法和逆轉(zhuǎn)錄

10、-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(TR-PCR)檢測其SSTR受體及其mRNA的表達(dá)情況。并用生長抑素類似物.奧曲肽進(jìn)行干預(yù)，流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)觀察用藥前后對肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期、凋亡及生長抑制作用的變化，利用配體與受體結(jié)合具有高特異性、高選擇性和高親和性的特點(diǎn)，采用放射性核素標(biāo)記的配體泡括激素、神經(jīng)遞質(zhì)及受體激動劑或阻斷劑等)作為顯像劑，可使之與高密度表達(dá)的腫瘤上相應(yīng)受體結(jié)合，而達(dá)到分子顯像的目的。同時，研究锝標(biāo)奧曲肽

11、作為腫瘤受體分子顯像劑診斷肝細(xì)胞肝癌的特異性、準(zhǔn)確性，并可根據(jù)本研究進(jìn)一步探討锝標(biāo)奧曲肽的顯像機(jī)理及其影響顯像質(zhì)量的分子生物學(xué)因素，從而為臨床提供更好的分子影像顯像劑，進(jìn)一步也可以為將來開展SSTR介導(dǎo)的分子靶向治療提供理論與現(xiàn)實(shí)基礎(chǔ)。
　　 目的：研究生長抑素受體在原發(fā)性肝癌(PLC)組織中的表達(dá)特性、荷人肝癌細(xì)胞HepG2裸鼠模型中受體分子顯像的攝取情況，為早期診斷肝細(xì)胞肝癌提供一種敏感度、特異度與準(zhǔn)確度都比較高的可進(jìn)行臨床

12、運(yùn)用的分子顯像診斷方法。
　　 方法：⑴用RT-PCR和免疫組化的方法了解生長抑素受體在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)；然后觀察奧曲肽(Octreotide)對肝癌細(xì)胞株的生長抑制和誘導(dǎo)凋亡現(xiàn)象。⑵建立裸鼠的腫瘤模型，用锝標(biāo)奧曲肽經(jīng)SPECT顯像儀對荷瘤裸鼠及正常裸鼠進(jìn)行動態(tài)顯像及0.5h，1h，2h，3h，4h，4.5h，5h，6h，24h的延遲顯像。應(yīng)用感興趣區(qū)(ROI)技術(shù)勾畫裸鼠的肝臟、肺臟、心臟及大腦的放射性計(jì)數(shù)、腫瘤部位的放射性

13、計(jì)數(shù)(T)，同時獲得30分鐘內(nèi)各感興趣區(qū)的時間(T)-放射性(A)圖。⑶通過腫瘤組織對放射性核素锝(99mTc)的攝取情況，間接揭示腫瘤組織對放射標(biāo)記奧曲肽(Octreotide)的攝取率，為放射標(biāo)記奧曲肽(Octreotide)用于原發(fā)性肝癌分子治療提供生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　 結(jié)果：①在生長抑素受體亞型在肝癌細(xì)胞株HepG2、QGY-7701和SMMC-7721中的表達(dá)不完全一致，但是它們所共同的是均為穩(wěn)定且高表達(dá)生長抑素受體亞型

14、1和亞型2(SSTR1、SSTR2)，并且均未發(fā)現(xiàn)SSTR3表達(dá)。由免疫組化亦證實(shí)SSTR1和SSTR2呈高表達(dá)。②99mTc-octreotide在正常裸鼠腎臟及肝臟內(nèi)分布較多，肺部及心臟部位放射性較低，頭部放射性分布最少，99mTc-octreotide主要通過泌尿系統(tǒng)排泄；頭部、肺部、心臟、肝臟部位30min內(nèi)放射性隨時間延遲逐漸下降。③注射99mTc-octreotide后3h～4h腫瘤顯像最清晰，檢查時間內(nèi)腫瘤部位放射性分布明