利用6His-VP3融合蛋白捕獲腫瘤細(xì)胞中與其相互作用蛋白的初步探討.pdf

1、VP3是雞貧血病毒的功能蛋白，分子量約14 ku，由121個氨基酸組成。由于VP3能夠特異性的誘導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生凋亡，而對正常細(xì)胞沒有凋亡誘導(dǎo)作用，因此又被稱為凋亡素，即Apoptin。
　　 大量研究證實：VP3的腫瘤特異性與其在細(xì)胞內(nèi)的定位有關(guān)。VP3定位于腫瘤細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，卻定位于正常細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。同時，VP3介導(dǎo)的腫瘤特異性的凋亡途徑，不依賴于p53蛋白，也不被抗凋亡分子Bcl-2所抑制。這一顯著特

2、點，使得VP3成為近年腫瘤特異性治療研究的熱點。
　　 現(xiàn)有資料顯示，VP3在腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中被未知激酶磷酸化。磷酸化的VP3進(jìn)入細(xì)胞核，定位于異染色質(zhì)和核仁，并與DNA結(jié)合形成蛋白-核酸復(fù)合物，可能參與抑制基因轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。同時，VP3還與大量的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，激活細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡途徑，引起腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的凋亡。
　　 但迄今為止，人們對VP3腫瘤特異性的凋亡誘導(dǎo)機制尚未完全闡明。近年研究的焦點多以V

3、P3相互作用蛋白為主，并試圖明確VP3作用通路上的各個成員，以揭示VP3特異性誘導(dǎo)凋亡的分子機制。因此，VP3相互作用蛋白的研究具有十分重要的意義。本研究采用PCR方法，從pcDNA-vp3重組質(zhì)粒DNA中擴增vp3的DNA片段，插入原核表達(dá)載體pET-28a(+)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a(+)-vp3。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工程菌DH5α內(nèi)進(jìn)行擴增培養(yǎng)，經(jīng)序列分析后，再將克隆正確的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌BL21中，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)6Hi

4、s-VP3融合蛋白。SDS-PAGE電泳分析，證明含6個組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白6His-VP3表達(dá)成功。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA親和樹脂純化分離，以獲得的純化的6His-VP3融合蛋白為誘餌，利用pull-down技術(shù)，捕獲其在腫瘤細(xì)胞HepG2與正常細(xì)胞L-02中相互作用的蛋白。通過SDS-PAGE電泳分析，顯示從HepG2細(xì)胞和L-02細(xì)胞中得到的VP3相互作用蛋白存在差異，這些差異可能正是VP3特異性凋亡效應(yīng)的關(guān)鍵所在。通過對這些蛋白