關于坐骨神經再生的機理.pdf

1、周圍神經損傷和缺損的治療是顯微外科的難題之一。不少學者從不同角度，采用多種方法進行了有益的探索，取得了很大的進展。近年來，隨著組織工程學的興起，對周圍神經缺損的修復探索出一條解決問題的捷徑。研制可生物降解的人工神經套管，將此套管植入缺損神經的近端和遠端之間，將兩端神經連接起來，在它們之間構建一個有利于神經再生的“微環(huán)境”，誘導損傷神經的再生與修復，將是很有前途的方法。目前，用于套接的材料很多，分兩大類，一類是合成材料，另一類是天然材料。

2、勞杰等證明用硅膠管，并輔以施萬細胞，能誘導正中神經再生。硅膠管有制備方便、不塌陷的優(yōu)點，但術后會產生致命的神經卡壓現象及炎性刺激，另外需要再次手術取出，所以并不適合臨床應用。靜脈管壁做為套管容易塌陷，而且其中的成纖維細胞易形成疤痕，阻礙神經生長。膠原膜套管具有排異反應小，可吸收、存儲方便的特點，適合臨床應用。王光林等以雪旺細胞與PLA構建組織工程化人工神經，修復周圍神經缺損的效果接近于自體神經移植。 第一軍醫(yī)大學自1991年以來

3、，采用經序貫生物化學特殊處理的人發(fā)角蛋白(humanhairkeratin,HHK)為醫(yī)學生物材料，成功研制出HHK人工腱。經動物實驗與臨床應用證明，該人工腱不僅具有其它傳統(tǒng)醫(yī)用材料的生物學特性，而且還具有以下特點：組織相容性好；可完全降解吸收，并能誘導形成具有正常功能的自體腱形成，從而表明HHK可以作為一種新型的醫(yī)用生物材料應用于臨床。 研究表明，將HHK制成套管，套接于離斷的坐骨神經兩端，發(fā)現HHK套管能橋接缺損的外周神經，

4、使損傷的周圍神經修復再生，肢體功能恢復正常；而且還發(fā)現連接于神經斷端、起定向作用的HHK絲上有大量的施萬細胞附著。在HHK誘導自體腱形成的研究也發(fā)現，植入的HHK絲上有大量的腱細胞附著，說明HHK具有良好的細胞附著性。但是HHK誘導坐骨神經再生的機理還不清楚，在該研究中應用HE染色，免疫組織化學，電鏡等方法系統(tǒng)的觀察了HHK誘導坐骨神經再生時的形態(tài)學變化，以揭示其誘導神經再生機理。 HHK神經套管還存在著一些缺點，如中空的管腔存

5、在著較大的間隙；管腔內無橋接體，不利于雪旺細胞的附著；HHK套管壁的孔隙太大，不能有效地在損傷局部聚集高濃度的細胞因子，不能有效的防止成纖維細胞的浸潤，不利于神經的再生。為此，為了進一步改進和完善HHK神經套管，該文將可降解的HHK為支架材料，以雪旺細胞為種子細胞，構建組織工程化神經，用于周圍神經損傷的再生修復。該文在HHK套管腔內充填HHK絲，建立橋接體，為細胞提供附著體，有效地引導神經再生。然而，充填HHK絲量多少為宜，如何調控它們

6、的降解，使其在適宜的時間內降解，都需要進一步研究。如果HHK絲過早吸收則不能引導神經再生，吸收太慢則會使材料滯留體內，對再生的神經產生局部壓迫作用。HHK具有快速、中速和慢速3個降解組分，所以調控HHK橋接體的降解是可行的。先前構建的HHK神經套管管壁孔隙太大，擬將管外壁附以膠原膜復合材料，構建具有屏障作用的半透膜。一方面可以在局部聚集有效濃度的細胞因子，另一方面有效地防止成纖維細胞的浸潤，防止疤痕形成，產生有效誘導神經再生的“微環(huán)境”

7、。關于種子細胞施萬細胞以何種形式構建組織工程化神經，現在還存在著分歧，為此，擬將基因修飾和未修飾的施萬細胞分別用于神經的構建，進而評價其效果。 該研究分為二章。 第一章體內HHK誘導大鼠損傷的坐骨神經再生的形態(tài)學機理 目的 觀察HHK絲束橋接體誘導坐骨神經再生過程中形態(tài)學變化，以揭示坐骨神經再生機理。同時比較HHK復合膠原膜對修復大鼠坐骨神經再生的效果 方法 制備坐骨神經損傷SD大鼠動物模

8、型，分別植入HHK或HHK+膠原屏障膜，于術后2d、1、3、6、9、12周取材進行HE染色，免疫組織化學染色，進行組織學觀察。 結果 大體觀察：HHK實驗組術后傷口愈合良好，無排異反應。HHK絲束橋接體植入體內1周后，肉眼觀察神經缺損處兩組表現相同；植入3周后，HHK絲束橋接體部分降解。植入后9周，HHK絲束橋接體周圍施萬細胞增多，HHK減少。植入后12周，可見HHK絲束已被明顯降解吸收，新生神經與正常神經接頭處已牢固的

9、融合在一起。HHK+膠原屏障膜實驗組則發(fā)現有堅硬的隆起。切開膠原屏障膜后發(fā)現由HHK誘導所形成的外膜隆起。組織學觀察：術后第2d到1周，切除后遠、近端的施萬細胞發(fā)生去分化，沿著HHK束表面縱向分裂增殖。術后第3周HHK開始降解，施萬細胞大量增生。HHK周圍可見很多巨噬細胞和多核巨細胞，并有軸突和大量微血管出現。術后第6周，在HHK絲周圍可見大量新生的神經纖維。術后第9周，HHK降解顯著，有明顯的神經外膜和束膜。術后第12周，HHK基本完

10、全降解，其部位被新的神經纖維所取代。HHK絲束+膠原膜屏障膜組與HHK絲束組在形態(tài)上沒有明顯的區(qū)別。 第二章體外HHK組織工程化神經的構建 第一節(jié)β-NGF、BDNF的克隆及其真核表達載體的構建 目的 為了提高SC分泌NGF及BDNF的活性，提取大鼠全腦RNA，克隆β-NGF基因、BDNF基因，同時構建其真核表達載體。 方法 從正常新生大鼠腦中提取全腦總RNA，以此總RNA為模板，應用RT

11、-PCR兩步法擴增神經生長因子基因和腦源性營養(yǎng)因子基因，把得到的基因片段分別重組到pUCm-T上，經轉化、篩選和鑒定得到含有大鼠的神經生長因子基因和腦源性營養(yǎng)因子基因的克隆。再將得到的基因分別重組到真核表達載體pEGFP-C2上，構建其真核表達載體。 結果 成功的克隆了大鼠β-NGF、BDNF基因，并分別構建了這兩個基因的真核表達載體。 第二節(jié)基因修飾施萬細胞與體外神經的構建 目的 應用可吸收生物

12、材料人發(fā)角蛋白復合β-NGF及BDNF基因修飾的新生大鼠施萬細胞制備體外組織工程化神經。 方法 應用雙酶消化法及差速貼壁法原代分離培養(yǎng)施萬細胞，通過脂質體轉染法將β-NGF及BDNF真核表達載體導入施萬細胞中，G418篩選陽性細胞，將HHK與陽性細胞共培養(yǎng)，研究其組織相容性。 結果 成功分離到新生大鼠施萬細胞，S-100蛋白標記SC細胞，純度達到96％。成功的分別將β-NGF及BDNF真核表達載體導入施

13、萬細胞中。并將HHK與基因修飾的施萬細胞共培養(yǎng)，細胞貼附在HHK上，生長良好，證實其有良好的生物相容性。將共培養(yǎng)的HHK和基因修飾的施萬細胞放入人發(fā)角蛋白套管中，構建成體外人發(fā)角蛋白組織工程化神經。 結論 1、該研究通過HHK絲束復合膠原膜修復大鼠坐骨神經損傷，證實HHK絲束是理想的神經再生的橋接體，它起到了神經再生過程中基膜管的作用。同時坐骨神經再生時會自身在HHK絲束周圍由結締組織形成一屏障膜，無需在HHK絲外加屏障

14、膜。 2、神經再生是從受損軸突潰變的清除生長錐的發(fā)生，施萬細胞髓鞘通過自噬、降解、胞質脫落、外排的形式清除，變?yōu)槿シ只氖┤f細胞，其中胞質脫落是去分化最重的一環(huán)。受損軸突立即發(fā)生保護性封閉、脫落。健康軸突形成膨大的帶突起的生長錐，生長錐突起上伸出許多絲狀生長芽，并與1到多個施萬細胞嵌合，它們通過競爭性選擇，最后只有一條生長芽可發(fā)育成完整的軸突。神經外膜、束膜、內膜是由血管屏障膜、纖維屏障膜演變而來的，它們是神經再生的重要環(huán)境因素