SP與脊髓星形膠質細胞活化的關系及在慢性前列腺炎疼痛中的作用探討.pdf

1、背景及目的：慢性前列腺炎疼痛是泌尿外科中青年男性極其常見的一種病癥。既往的研究主要集中于前列腺本身病因的探討，而缺乏對前列腺炎疼痛的傳導通路和神經調控機制的研究。目前研究發(fā)現(xiàn)部分慢性前列腺炎疼痛呈現(xiàn)出兩個明顯的特點：一、疼痛的泛化，疼痛不僅限于前列腺所在部分，而是分布在與膀胱尿道神經支配相關的骶神經支配區(qū)，在沒有原發(fā)病變的其它部位可出現(xiàn)自發(fā)疼痛，并不同程度地存在著膀胱和尿道肌肉的功能障礙，表現(xiàn)出內臟牽涉痛的特點；二、疼痛的持續(xù)，臨床上可

2、見有些前列腺炎疼痛在前列腺檢查完全正常后仍存在持續(xù)疼痛。所以各種臨床現(xiàn)象提示：慢性前列腺炎疼痛極可能是一種持續(xù)的神經牽涉痛，其疼痛的發(fā)生估計與支配前列腺的L<,5>-S<,2>脊段的改變有關。 本室對慢性前列腺炎疼痛的系列研究(見宋波，周占松，陳勇等的工作)現(xiàn)已得到了如下結果：1．成功構建了慢性前列腺炎疼痛的大鼠模型；2．進一步證實慢性前列腺炎疼痛是中樞位于L<,5>-S<,2>脊段的神經牽涉痛。但對于慢性前列腺炎疼痛L<,5>

3、-S<,2>脊段神經調控機制的相應變化仍不清楚。 目前研究證實，星形膠質細胞和SP(P Substallce，P物質)參與了多種慢性疼痛的發(fā)生，部分神經軀體痛模型中已發(fā)現(xiàn)相應脊段存在星形膠質細胞的活化和SP免疫活性的增強，但對于星形膠質細胞和SP在慢性前列腺炎疼痛中的作用尚無相關研究，因此，進一步研究SP與脊髓星形膠質細胞在慢性前列腺炎疼痛L<,5>-S<,2>脊段中的改變及相互之間的關系，將對闡明部分慢性前列腺炎疼痛的發(fā)生機理

4、具有重要意義。 一、活化的星形膠質細胞參與多種慢性疼痛的調制。隨著對中樞神經系統(tǒng)研究的深入，發(fā)現(xiàn)痛覺的傳導和調制不僅僅是神經元的功能，星形膠質細胞也通過和神經細胞的相互作用參與了病理性疼痛的產生和維持。已有研究發(fā)現(xiàn)星形膠質細胞在神經病變中存在免疫和內分泌方面的病理改變，不僅影響致痛遞質谷氨酸的代謝，還可通過旁分泌和內分泌等方式，產生多種致炎因子和趨化因子，如TNF，IL-1，IL-6等，和慢性疼痛的產生密切相關。 二、S

5、P是一種重要的致痛神經遞質和調質。SP通過從初級傳入神經釋放后作用于脊髓背角相應的受體，向中樞傳遞傷害性刺激和痛覺，廣泛參與痛覺的傳導和調制，在多種慢性疼痛中表達升高。目前對于慢性前列腺炎疼痛大鼠L<,5>-S<,2>脊髓是否存在星形膠質細胞活化和SP表達的具體變化，以及二者之間的相互關系尚不清楚，有待進一步的研究。 本課題作為向該研究方向探索的一個分題，主要對慢性前列腺炎疼痛中L<,5>-S<,2>脊段的星形膠質細胞活化參與疼

6、痛調制的細胞分子機制、信號通路以及其中SP的作用進行研究，以期初步闡明慢性前列腺炎疼痛的部分神經調控機制并為臨床上的相應的治療提供新的參考思路。 方法： 1．第一部分觀察慢性前列腺炎疼痛是否存在L<,5>-S<,2>脊段SP合成、相應受體表達及星形膠質細胞活化和炎性因子分泌的變化，即通過制作大鼠慢性前列腺炎疼痛模型，分別應用FQ-RT PCR(實時熒光定量RT PCR)和Western-blot檢測L<,5>-S<,2>

7、脊段DRG(dorsal rootganglion，背根神經節(jié))傳入神經細胞SP合成和脊髓后角NK-1R(SP受體)、GFAP(glialfibrillary acidic protein，膠質纖維酸性蛋白)、iNOS和TNF-α表達的變化。 2．第二部分在體外觀察SP是否促使脊髓星形膠質細胞活化、分泌炎性因子及影響谷氨酸代謝，即通過體外培養(yǎng)大鼠脊髓星形膠質細胞，采用不同濃度的SP在一定時間刺激培養(yǎng)的細胞，利用ELISA法，硝酸

8、還原酶和比色法檢測星形膠質細胞IL-1β、TNF-α、NO分泌和NOS表達的變化，<'3>H-Glu摻入法檢測谷氨酸的摻入；RT-PCR法檢測GFAP和GLT-1(glutamate transporter-1，谷氨酸轉運體-1)的表達。 3．第三部分對SP激活脊髓星形膠質細胞的信號轉導途徑進行初探，即利用一定濃度的SP在不同時間刺激培養(yǎng)的細胞，通過Western-blot檢測P38MAPK的磷酸化變化和RT-PCR法檢測C-f

9、os的改變，及SB203580阻斷P38MAPK信號通路后上述炎性因子分泌的變化。 結果： 1．大鼠前列腺注射CFA的慢性前列腺炎疼痛模型中，L<,5>-S<,2>脊髓DRG神經元中的SP合成和脊髓背角NK-1R的表達在6d和12d均明顯高于對照組(P<0.01)，12d和6d組明顯高于0d組(P<0.01)。 2．慢性前列腺炎疼痛大鼠中L<,5>-S<,2>脊髓背角中GFAP、TNF-α、iNOS表達在6d和1

10、2d均明顯高于各自正常對照組和0d組(P<0.01)，GFAP 12d組高于6d組(P<0.05)，iNOS的表達高峰在6d組(P<0.01)。 3．成功分離、培養(yǎng)和純化大鼠的脊髓星形膠質細胞，并用GFAP鑒定純度達95％以上。 4．SP在10<'-9>-10<'-6>mol/L濃度范圍內呈濃度依賴性促進脊髓星形膠質細胞分泌TNF-α、IL-1β、NO和NOS，各濃度組與對照組相比差異顯著(P<0.01，P<0.05)，

11、但在10<'-6>mol/L SP作用組，IL-1β的分泌下降且與正常對照組沒有明顯差異(P>0.05)。 5．在SP(10<'-7>mol/L)的作用下，脊髓星形膠質細胞內GFAP的表達在0-72h逐漸升高，與正常對照組相比差異非常顯著(P<0.01)。 6．脊髓星形膠質細胞在SP的刺激下，<'3>H-Glu的攝取逐漸下降，10<'-9>mol/l組與正常對照組有顯著差異(P<0.05)，10<'-8>-10<'-6

12、>mol/L SP作用下，脊髓星形膠質細胞<'3>H-Glu攝取與正常對照組有非常顯著差異(P<0.01)。 7．脊髓星形膠質細胞GLT-1的表達在10<'-9>-10<'-8>mol/L SP作用組和正常對照組沒有顯著差異(P>0.05)，10<'-7>-10<'-6>mol/L SP刺激組GLT-1表達值低于正常對照組(P<0.05，P<0.01)。 8．SP(10<'-7>mol/L)刺激使P38MAKP明顯磷酸化

13、活化，其光密度值在15、30、45、60min均明顯高于對照組(P<0.05，P<0.01)，表達高峰在45min。 9．SP(10<'-7>mol/L)作用使C-fos明顯表達，在30min、1h、3h、6h均明顯高于對照組(P<0.05，P<0.01)，在3h達到高峰。 10．SP(10<'-7>mol/L)刺激脊髓星形膠質細胞明顯分泌炎性因子IL-1β、TNF-α和NO(P<0.01)，SB203580阻斷P38M

14、AKP信號通路后TNF-α和NO的分泌明顯下降(P<0.01)，IL-1β的分泌在阻斷前后沒有顯著差異(P>0.05)，單純SB203580阻斷組和正常對照組間均無明顯差異(P>0.05)。 結論： 1．成功制作了慢性前列腺炎疼痛大鼠模型，并觀察到L<,5>-S<,2>脊段存在致痛神經遞質SP作用的增強。 2．慢性前列腺炎疼痛可以引起L<,5>-S<,2>脊髓背角星形膠質細胞標志物GFAP表達增加，炎性因子TNF

15、-α和iNOS表達升高，表明慢性前列腺炎疼痛可以導致L<,5>-S<,2>脊髓中樞繼發(fā)的星形膠質細胞活化及炎性改變，可能與慢性前列腺炎疼痛的持續(xù)和泛化有密切關系。 3．SP刺激下的脊髓星形膠質細胞GFAP、TNF-α，IL-1β、NO、NOS合成增加，表明脊髓星形膠質細胞活化與SP誘導有明顯關系。結合動物實驗的結果證明：慢性前列腺炎疼痛中SP誘導下脊髓星形膠質細胞活化和炎性因子分泌可以導致L<,5>-S<,2>脊段神經炎性痛反應