嗜酸乳桿菌對(duì)重型顱腦損傷后腸ICC和Cx43影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、重型顱腦損傷(severeheadinjury,SHI)后因中樞神經(jīng)系統(tǒng)的受累、缺血再灌注的打擊以及顱內(nèi)壓升高等因素,使得胃腸動(dòng)力障礙(gastrointestinalmotilitydisturbances,GMD)的發(fā)生率高達(dá)80％以上,較其他創(chuàng)傷所致的GMD出現(xiàn)時(shí)間早,程度更重,嚴(yán)重影響救治效果和預(yù)后。臨床上以腸動(dòng)力不足更為常見。因此,有效恢復(fù)SHI后的腸動(dòng)力有益于改善患者的臨床結(jié)局。SHI后的腸動(dòng)力不足主要表現(xiàn)為腸蠕動(dòng)減慢或消失

2、,遷移型復(fù)合波減少等。近年研究表明,Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitialcellsofCajal,ICC)是胃腸運(yùn)動(dòng)的起搏器及基本功能單位,其網(wǎng)絡(luò)受損或缺失會(huì)導(dǎo)致胃腸動(dòng)力異常。縫隙連接是介導(dǎo)胃腸平滑肌細(xì)胞和ICC間電化學(xué)信息交流的特殊通道。連接蛋白Cx43是此通道的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),在ICC胞體和突起上均有表達(dá),其表達(dá)異常亦與胃腸動(dòng)力障礙密切相關(guān)。提示,維護(hù)腸道ICC網(wǎng)絡(luò)及縫隙連接對(duì)扭轉(zhuǎn)SHI后腸道動(dòng)力不足,減少并發(fā)癥的發(fā)生具有重要意義

3、。
　　益生菌是具有雙向調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力且無藥物毒副作用的一種微生態(tài)制劑,可以改善感染、功能性消化不良等疾病引起的胃腸動(dòng)力不足[1-2]。本課題組研究發(fā)現(xiàn),益生菌不僅能使SHI患者的排便時(shí)間顯著提前;還可促進(jìn)傷后大鼠的胃排空,改善腸道菌群失調(diào)等。但益生菌通過何種途徑對(duì)創(chuàng)傷后胃腸動(dòng)力進(jìn)行的調(diào)控機(jī)制尚不清楚,因此有必要對(duì)其進(jìn)行深入研究。為探討其作用機(jī)理,本實(shí)驗(yàn)選用益生菌中重要的單菌之一嗜酸乳桿菌,采用自制圓柱套桿撞擊器,使用改良的自由落體

4、撞擊法建立SHI后腸動(dòng)力障礙小鼠模型,通過觀察SHI后小鼠末端回腸離體肌條運(yùn)動(dòng),檢測(cè)腸肌叢ICC數(shù)量,觀測(cè)小腸組織Cx43蛋白表達(dá)的變化,分析ICC、Cx43與SHI后發(fā)生腸動(dòng)力不足的關(guān)系;同時(shí)通過觀察嗜酸乳桿菌干預(yù)后對(duì)上述指標(biāo)的影響,探討嗜酸乳桿菌對(duì)小腸肌條收縮、ICC和Cx43的調(diào)節(jié)作用及可能機(jī)制,以期為嗜酸乳桿菌的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。本研究數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方

5、差分析和獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),P<0.05表示差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01表示差異具有非常顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　第一部分重型顱腦損傷小鼠腸動(dòng)力障礙模型的建立
　　目的:成功建立SHI后腸動(dòng)力障礙的小鼠模型,適用于SHI后腸動(dòng)力不足的研究;且模型可操作性強(qiáng),穩(wěn)定性、重復(fù)性好,比現(xiàn)有顱腦損傷模型致死率低。
　　方法:60只健康雄性C57BL/6小鼠(體重21±3g),隨機(jī)數(shù)字表法分為假傷組和創(chuàng)傷組,采用自制圓柱套桿撞

6、擊器對(duì)小鼠致傷,假傷組只開骨窗不致傷。傷后1h、6h、1d、3d、7d檢測(cè)腦含水量,神經(jīng)行為學(xué)變化,小腸推進(jìn)率;光鏡下觀察腦、腸組織的病理學(xué)改變,判定損傷后是否存在腸動(dòng)力障礙以構(gòu)建SHI后腸動(dòng)力障礙模型。
　　結(jié)果:創(chuàng)傷組小鼠打擊后即刻出現(xiàn)原發(fā)性昏迷,傷后存在肢體活動(dòng)受限,2~4h清醒后反應(yīng)遲鈍,1h、6h、1d、3d、7d的神經(jīng)學(xué)評(píng)分較假傷組均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與傷后1h比較,傷后3d、7d均有不同程度的改善(

7、P<0.05,P<0.01);腦含水量在傷后1h即增加(P<0.05),6h增加明顯(P<0.01),24h達(dá)峰值,3d后逐漸下降,7d后接近正常;腦組織病理變化符合重型顱腦損傷的變化過程。同時(shí)在致傷后1h,致傷組小鼠小腸推進(jìn)率即下降(P<0.05),6h達(dá)到最低值,傷后1d小腸推進(jìn)率持續(xù)下降(P<0.01);腸道病理亦顯示出現(xiàn)急性炎癥、出血和血管擴(kuò)張等改變。以上特征提示該模型建立成功。
　　結(jié)論:制備的SHI后腸動(dòng)力障礙小鼠模型

8、,適用于損傷后腸動(dòng)力障礙的實(shí)驗(yàn)研究。
　　第二部分嗜酸乳桿菌對(duì)重型顱腦損傷后腸ICC和Cx43影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:闡明重型顱腦損傷后腸動(dòng)力障礙小鼠ICC及細(xì)胞連接蛋白Cx43的變化;探討嗜酸乳桿菌對(duì)SHI后腸動(dòng)力不足的改善作用,初步探明嗜酸乳桿菌保護(hù)損傷后腸運(yùn)動(dòng)功能的機(jī)理。
　　方法:72只清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠(體重20±2g)用第一部分方法致傷,按隨機(jī)數(shù)字表法分為假傷組、創(chuàng)傷組和嗜酸乳桿菌組(嗜酸乳桿菌

9、干預(yù)的創(chuàng)傷組),每組8只。各組均自由飲食,每天灌胃一次。嗜酸乳桿菌組于傷后6h將嗜酸乳桿菌(菌株為YIT2004,由上海信誼制藥廠饋贈(zèng))溶于培養(yǎng)基中灌胃,每只小鼠喂養(yǎng)量不低1x1010cfu/d;假傷組、創(chuàng)傷組灌同體積培養(yǎng)基溶液。于傷后3、7、14d取材,通過多通道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)監(jiān)測(cè)小鼠小腸離體平滑肌收縮運(yùn)動(dòng),觀察肌條收縮頻率、幅度、張力的變化。免疫熒光法檢測(cè)ICC和Westernblot法檢測(cè)Cx43的變化。
　　結(jié)果:<

10、br>　　1.小腸離體肌條收縮運(yùn)動(dòng)
　　①假傷組各時(shí)相點(diǎn)肌條收縮模式規(guī)律,呈正弦波,波形光滑、連續(xù)。②傷后3d、7d,創(chuàng)傷組肌條運(yùn)動(dòng)與假傷組比較,平滑肌收縮幅度減弱、張力降低及頻率減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),且收縮節(jié)律紊亂,波動(dòng)時(shí)高時(shí)低,甚至波幅消失,且放大相同倍數(shù)后波形多銳化;14d時(shí)頻率與假傷組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。③嗜酸乳桿菌組傷后3d、7d肌條收縮張力及頻率較假傷組有不同程度紊亂(P<0.05

11、),但相對(duì)創(chuàng)傷組,3d肌條收縮張力具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。同時(shí)其運(yùn)動(dòng)模式規(guī)律,收縮幅度和頻率均有明顯提高(P<0.01),且放大后波形連續(xù),多數(shù)波形光滑,少數(shù)呈尖銳化。
　　2.小腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)的形態(tài)與數(shù)量
　?、偌賯M,小腸腸肌叢ICC呈長(zhǎng)梭型或星狀,細(xì)胞核大且DAPI染色清晰,有2~3個(gè)長(zhǎng)分支,并與肌纖維或神經(jīng)纖維平行走行,相互間形成完整網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu),網(wǎng)絡(luò)密集。②創(chuàng)傷組,各時(shí)相點(diǎn)的末端回腸ICCki

12、t陽性細(xì)胞數(shù)量減少,顯著低于假傷組(P<0.01),ICC分支變少且網(wǎng)絡(luò)稀疏,相互間以及與平滑肌間出現(xiàn)較大的細(xì)胞間隙;③而嗜酸乳桿菌組3d的末端回腸ICC細(xì)胞數(shù)量明顯少于假傷組(P<0.05),14d仍未達(dá)到假傷水平;但與創(chuàng)傷組相比,嗜酸乳桿菌組3d、7d、14d的細(xì)胞數(shù)量均顯著增多(P<0.01),網(wǎng)絡(luò)明顯增多、密集。
　　3.腸組織縫隙連接蛋白43(Cx43)的表達(dá)
　　創(chuàng)傷組各時(shí)相點(diǎn)與假傷組比較,Cx43蛋白表達(dá)量下降

13、,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);嗜酸乳桿菌組相對(duì)假傷組,雖然7d蛋白表達(dá)量有顯著下降(P<0.01),但與創(chuàng)傷組比較,3d、14d蛋白表達(dá)量均明顯高于創(chuàng)傷組(P<0.01,P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.重型顱腦損傷后3d即出現(xiàn)腸道平滑肌自主收縮運(yùn)動(dòng)紊亂,收縮幅度和頻率降低,收縮運(yùn)動(dòng)減弱。
　　2.重型顱腦損傷后腸肌叢ICC發(fā)生損傷,其數(shù)量減少,網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞,且損傷后修復(fù)至少需要14d;重型顱腦損傷后腸組

14、織Cx43表達(dá)減少,細(xì)胞連接受損。
　　3.腸肌叢ICC數(shù)量減少和網(wǎng)絡(luò)受損,以及Cx43的表達(dá)缺失或減少,是造成腸神經(jīng)-ICC-平滑肌網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)電信號(hào)傳遞障礙,引起腸道收縮模式紊亂,導(dǎo)致腦損傷后動(dòng)力障礙的可能機(jī)制之一。
　　4.嗜酸乳桿菌能改善重型顱腦損傷后肌條幅度降低,頻率減少,張力降低而導(dǎo)致的收縮性減弱;降低ICC數(shù)量減少的程度,增加縫隙連接蛋白Cx43的表達(dá),修復(fù)胃腸道基本功能單位的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu),使其發(fā)揮正常作用。