顳葉癲癇共阿爾茨海默氏病樣神經(jīng)病變實(shí)驗(yàn)病理學(xué)探討.pdf

1、第一部分癲癇CD1小鼠前腦淀粉樣斑及tau病變相關(guān)蛋白表達(dá)
　　實(shí)驗(yàn)原理與目的:以往顳葉癲癇人腦病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)淀粉樣斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)等阿爾茨海默病(AD)樣病理改變。嚙齒類皮羅卡品癲癇模型能重建人顳葉癲癇的大部分病理學(xué)、異常腦電腦活動及癲癇行為學(xué)改變。本部分實(shí)驗(yàn)擬采用CD1小鼠建立皮羅卡品癲癇模型。通過行為學(xué)、電生理及經(jīng)典組織學(xué)方法證實(shí)小鼠模型的成功建立。在此基礎(chǔ)上，觀察和確立與淀粉樣斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成相關(guān)的蛋白表達(dá)在癲癇小

2、鼠腦內(nèi)的變化及其程度。
　　材料與方法:采用2月齡成年CD1小鼠，腹腔注射皮羅卡品誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性顳葉癲癇，對照組腹腔注射生理鹽水。在不同存活時間點(diǎn)(24-48小時，及7、14、30、60天)進(jìn)行電生理和/或腦組織學(xué)處理。組織學(xué)與免疫組織化學(xué)染色比較癲癇和對照動物海馬和邊緣系統(tǒng)區(qū)域的細(xì)胞構(gòu)筑、軸突芽生，淀粉樣蛋白(Aβ)及其生成酶貝塔分泌酶1(BACE1)、磷酸化tau和其他相關(guān)神經(jīng)元標(biāo)記物表達(dá)和分布。
　　結(jié)果:行為學(xué)和電生理檢

3、測證實(shí)皮羅卡品處理CD1小鼠表現(xiàn)復(fù)發(fā)性痙攣癲癇發(fā)作和海馬癇性放電。Timm染色和神經(jīng)肽(NPY)免疫組化證實(shí)癲癇小鼠CA3區(qū)苔蘚纖維末梢芽生。存活7天及以上癲癇動物尼氏染色顯示海馬CA1和CA3區(qū)細(xì)胞死亡。在存活7至60天組癲癇小鼠，貝塔分泌酶1(BACE1)上調(diào)伴隨苔蘚纖維及梨狀皮質(zhì)、杏仁核等亞區(qū)軸突芽生，以及局部樹突標(biāo)志物MAP2免疫反應(yīng)缺失。癲癇小鼠未表現(xiàn)細(xì)胞外淀粉樣蛋白沉著和磷酸化人樣tau蛋白過表達(dá)。
　　總結(jié)與結(jié)論:匹

4、羅卡品誘導(dǎo)CD1小鼠產(chǎn)生慢性復(fù)發(fā)性顳葉癲癇行為學(xué)和神經(jīng)病理學(xué)改變。海馬和其它顳葉區(qū)域出現(xiàn)局部BACE1表達(dá)上調(diào)，定位于異常芽生軸突末梢。在BACE1上調(diào)的同一區(qū)域，存在樹突成分損傷或丟失。在缺乏人為（病理/態(tài)基因）誘導(dǎo)可能產(chǎn)生腦可溶性Aβ高水平的前提下，顳葉癲癇腦內(nèi)發(fā)生過度生成Aβ的神經(jīng)元調(diào)控變化;盡管在成年CD1小鼠，實(shí)驗(yàn)性癲癇未引起典型腦淀粉樣斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)病變。
　　第二部分轉(zhuǎn)基因3×Tg-AD小鼠AD樣神經(jīng)病理發(fā)生與演

5、化
　　實(shí)驗(yàn)原理與目的:轉(zhuǎn)基因3×Tg-AD小鼠隨年齡發(fā)育而出現(xiàn)腦組織細(xì)胞外淀粉樣斑和神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白過磷酸化病變。本實(shí)驗(yàn)將對課題組繁殖的3×Tg-AD小鼠淀粉樣斑和tau病變的年齡和腦區(qū)域相關(guān)性演化進(jìn)行評估。此外，尚無研究報道3×Tg-AD小鼠腦內(nèi)是否存在BACE1表達(dá)異常。本實(shí)驗(yàn)也旨在明確BACE1與3×Tg-AD小鼠腦淀粉樣斑病變的相關(guān)性。
　　材料與方法:采用雄性3×Tg-AD及非轉(zhuǎn)基因小鼠，1-26月齡。腦組織行

6、生化和免疫組化分析。各月齡組腦鄰片進(jìn)行B ACE1，Aβ和磷酸化tau(p-tau)染色。特定年齡組腦切片行熒光雙標(biāo)(1)BACE1與Aβ、p-tau，(2) N-端，中段或C-端特異性Aβ抗體交互雙標(biāo)，(3)BACE1與特異神經(jīng)元標(biāo)記物。免疫印跡法檢測BACE1和其直接產(chǎn)物淀粉樣蛋白前體(APP)貝塔位點(diǎn)剪切片段(β-CTF)水平，酶試劑盒檢測BACE1酶活性。
　　結(jié)果:(1)3×Tg-AD小鼠前腦內(nèi)12-14月齡開始出現(xiàn)Aβ

7、染色陽性淀粉樣斑，始見于海馬下托，隨年齡擴(kuò)展至海馬與皮質(zhì)各層，可見致密型斑，但多為彌散型。BACE1陽性失營養(yǎng)性突起的出現(xiàn)和擴(kuò)展呈現(xiàn)上述相同時空演化過程。(2) AβN-端(3D6，6E10)和中段(4G8，E50)特異抗體顯示皮質(zhì)和海馬錐體神經(jīng)元胞體，2月齡即出現(xiàn)。經(jīng)強(qiáng)蟻酸切片預(yù)處理，還標(biāo)記腫脹樣軸突末梢，4-6月齡開始出現(xiàn)。這些軸突末梢可被BACE1及β-CTF抗體熒光共標(biāo)記。(3) AβC-端特異抗體僅顯示胞外淀粉樣蛋白沉著。(4

8、)磷酸化tau蛋白反應(yīng)產(chǎn)物存在于部分皮質(zhì)和海馬錐體神經(jīng)元胞體和樹突，2月齡即出現(xiàn)，隨年齡增加而增強(qiáng)。(5)與非轉(zhuǎn)基因小鼠相比，3×Tg-AD小鼠腦BACE1、β-CTF、BACE1酶活性水平從12-14月齡開始增加，18-22月齡達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　總結(jié)與結(jié)論:3×Tg-AD小鼠腦淀粉樣和tau病變表現(xiàn)年齡和區(qū)域相關(guān)性發(fā)生和進(jìn)展過程，但兩者之間無明顯相關(guān)性。腦淀粉蛋白沉積可表現(xiàn)為致密型和彌散型，兩者的發(fā)生可能均與先期出現(xiàn)的軸突病

9、變有關(guān)。早期軸突病變表現(xiàn)為腫脹和芽生，伴隨BACE1和一些Aβ抗體染色陽性染色，后者可能代表APPβ-CTF聚集。BACE1上調(diào)在3×Tg-AD小鼠腦淀粉樣斑的起始和演化過程中扮演關(guān)鍵作用。
　　第三部分癲癇3×Tg-AD小鼠AD樣神經(jīng)病理發(fā)生與變化
　　實(shí)驗(yàn)原理與目的:我們在第一部分實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腦BACE1上調(diào)伴隨癲癇CD1小鼠邊緣系統(tǒng)病理性軸突芽生。第二部分實(shí)驗(yàn)證實(shí)BACE1上調(diào)定位于早期腫脹軸突末梢和失營養(yǎng)性神經(jīng)突起，并伴

10、隨3×Tg-AD小鼠腦淀粉樣斑發(fā)生過程。本部分研究從實(shí)驗(yàn)病理學(xué)角度探討皮羅卡品癲癇是否提前和促進(jìn)3×Tg-AD小鼠腦淀粉樣斑和tau病變。本實(shí)驗(yàn)旨在檢測癲癇腦內(nèi)進(jìn)行性軸突病變因伴隨BACE1上調(diào)會腦區(qū)域特異性的引起淀粉樣斑形成，也可能與tau蛋白過度磷酸化相關(guān)。通過這些觀察，試圖闡述顳葉癲癇表現(xiàn)AD樣神經(jīng)病變的病理發(fā)生機(jī)制。
　　材料與方法:采用6-8月齡雄性3×Tg-AD小鼠，皮羅卡品腹腔注射誘導(dǎo)急性痙攣性驚厥，對照組腹腔注射生

11、理鹽水。錄像監(jiān)控證實(shí)皮羅卡品組動物出現(xiàn)發(fā)作性、痙攣性驚厥。動物存活至9、11和14月齡(n=4/年齡組)，行腦組織學(xué)與免疫組織化學(xué)檢測，對海馬和邊緣系統(tǒng)區(qū)域的細(xì)胞構(gòu)筑、BACE1、APP、Aβ、p-tau和神經(jīng)元特異核抗原(NeuN)免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物進(jìn)行定性定量分析。
　　結(jié)果:(1)與對照組相反，癲癇3×Tg-AD小鼠呈現(xiàn)典型海馬苔蘚纖維芽生，表現(xiàn)為齒狀回分子層內(nèi)份出現(xiàn)BACE1強(qiáng)染色帶。(2)在9和11月齡癲癇小鼠，海馬、梨狀

12、皮質(zhì)和杏仁核出現(xiàn)BACE1陽性失營養(yǎng)性神經(jīng)突起簇、而對照組無或罕見此類結(jié)構(gòu)。在14月齡癲癇小鼠，這些失營養(yǎng)性神經(jīng)突起簇的數(shù)目多于對照組，且分布比對照組廣泛。(3)雙重標(biāo)記分析表明BACE1陽性失營養(yǎng)性神經(jīng)突起為軸突成分，且伴隨局灶性細(xì)胞外Aβ沉積。(4)定量分析表明癲癇小鼠海馬CA1和下托區(qū)失營養(yǎng)性神經(jīng)突起簇和淀粉樣斑光密度均高于對照組。(5)與對照組相比，9、11和14月齡癲癇小鼠齒狀回分子層、顆粒細(xì)胞層和苔蘚纖維終末p-tau染色增

13、強(qiáng)，而在CA1區(qū)p-tau產(chǎn)物減少。(6)9、11和14月齡癲癇小鼠CA1、CA3區(qū)和梨狀皮質(zhì)出現(xiàn)細(xì)胞丟失和NeuN免疫反應(yīng)下降。
　　總結(jié)與結(jié)論:和對照轉(zhuǎn)基因動物相比，匹羅卡品誘導(dǎo)的慢性癲癇3×Tg-AD小鼠邊緣系統(tǒng)部分區(qū)域出現(xiàn)更早和更嚴(yán)重的淀粉樣斑病變和神經(jīng)元內(nèi)磷酸化tau表達(dá)。癲癇3×Tg-AD小鼠腦內(nèi)這兩種AD樣病變與神經(jīng)元損傷和死亡存在區(qū)域性相關(guān)。BACE1過表達(dá)是慢性癲癇動物受損傷腦區(qū)軸突芽生及失營養(yǎng)性變的內(nèi)在信號分子