人類臍帶基質(zhì)來源干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其向內(nèi)皮細(xì)胞方向分化的研究.pdf

1、目的：本文旨在從人類臍帶基質(zhì)中分離干細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)，研究其表型特征和體外向內(nèi)皮細(xì)胞方向分化的潛能。
　　 方法：經(jīng)家屬同意取足月健康產(chǎn)婦的新生兒臍帶用于本研究。無菌條件下獲取臍帶，以D-Hank’s平衡鹽溶液充分沖洗臍帶外周及臍動(dòng)、靜脈管腔，剔除臍動(dòng)、靜脈，將剩余的臍帶基質(zhì)組織切割成約1mm3大小的組織塊均勻覆蓋于培養(yǎng)瓶，加入DMEM-LG/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育。2～3周左右細(xì)胞達(dá)到8

2、0％～90％融合時(shí)，用胰蛋白酶/EDTA（0.25％/0.02％）混合液消化傳代。細(xì)胞凍存使用含10％二甲基亞砜和90％胎牛血清的凍存液。用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線來說明細(xì)胞生長(zhǎng)方式。取第3代細(xì)胞以流式細(xì)胞法行細(xì)胞表型鑒定，包括CD34、CD44、CD45、CD54、CD73、CD90、CD105、CD106、CD133以及同型對(duì)照抗體。之后將傳代培養(yǎng)的細(xì)胞按照5×104/ml的密度重新接種24孔板中，用包括10ng/ml血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、10ng

3、/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10％胎牛血清的DMEM-LG/F12培養(yǎng)液向內(nèi)皮細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化。倒置相差顯微鏡下每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)。應(yīng)用流式細(xì)胞儀于誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后分析、鑒定向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后內(nèi)皮細(xì)胞表型CD34、假性血友病因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2的變化。然后熒光顯微鏡觀察誘導(dǎo)分化后細(xì)胞攝取乙?；兔芏戎鞍啄芰σ澡b定其功能。最后應(yīng)用熒光顯微鏡對(duì)誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞進(jìn)行攝取乙?；兔芏戎鞍缀捅磉_(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2的鑒定。

4、
　　 結(jié)果：在原代培養(yǎng)3～7天后，可見細(xì)胞由組織塊中游出，并逐漸增多，圍繞在組織塊周圍呈放射狀貼壁生長(zhǎng)，主要是長(zhǎng)梭形的成纖維樣細(xì)胞，也有扁平狀胞質(zhì)豐富的細(xì)胞。2～3周后當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80％～90％融合時(shí)用胰蛋白酶/EDTA（0.25％/0.02％）混合液消化，之后按1：2～1：3的比例接種于新的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代，接種后數(shù)小時(shí)內(nèi)可見其迅速貼壁。之后細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，3～4天可達(dá)80％～90％融合，在低倍顯微鏡下可見其呈排列緊密的漩渦樣結(jié)

5、構(gòu)。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線表明細(xì)胞生長(zhǎng)方式呈“S”形。流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)這些細(xì)胞表達(dá)通常被認(rèn)為是間充質(zhì)干細(xì)胞的表型CD105、CD73、CD90、CD54、CD44，而不表達(dá)造血細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的表型CD34，CD45、CD106和CD133。使用含血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的內(nèi)皮細(xì)胞分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)傳代后的人類臍帶基質(zhì)來源干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞方向分化，3天后可見管腔樣結(jié)構(gòu)形成。流式細(xì)胞儀分析表明，誘導(dǎo)分化前內(nèi)皮細(xì)胞表型CD34、假性血友病