碳青霉烯類藥物聯(lián)合舒巴坦或頭孢哌酮對(duì)銅綠假單胞菌的藥敏對(duì)比研究.pdf

1、目的：
　　 探討碳青霉烯類藥物聯(lián)合應(yīng)用舒巴坦或頭孢哌酮等對(duì)銅綠假單胞菌(PA)的抗菌作用。
　　 方法：
　　 1.K-B法測(cè)定藥敏及聯(lián)合藥敏120株臨床株P(guān)A，來于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院細(xì)菌室、山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附院細(xì)菌室，均為致病菌株。K-B法測(cè)定藥敏及聯(lián)合藥敏。根據(jù)抑菌環(huán)形態(tài)分為協(xié)同、相加、無關(guān)、拮抗。按藥敏分為敏感菌株、多耐藥菌株(Multipledrugresistant，MDR)、泛耐藥菌株(Pandru

2、gresistant，PDR)、廣耐藥菌株(ExtensiveDrugResistantXDR)。舒巴坦(Sulbactam，SUB)藥敏紙片為自行制作，含量125μg。以協(xié)同+相加記為協(xié)同率。
　　 2.聯(lián)合MIC測(cè)定:
　　 2.1抗菌藥物原液配制選取48株P(guān)A進(jìn)行下一步的聯(lián)合MIC測(cè)定，分別為敏感菌株、MDR、XDR、PDR各12株。用pH7.2滅菌磷酸鹽緩沖液將藥物分別稀釋為:比阿培南、亞胺培南、磷霉素、頭孢哌酮

3、、舒巴坦5120μg/mL;阿米卡星1280μg/mL;環(huán)丙沙星2560μg/mL。
　　 2.2單藥孔板制備分別取上述各種抗菌藥物原液10μL加入90μLMH肉湯中，然后做倍比稀釋（取50μL放入第2孔中，依次類推）。共稀釋16孔使得各濃度為:比阿培南、亞胺培南、磷霉素、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢哌酮、舒巴坦512、256～0.016μg/mL;阿米卡星128～0.004μg/mL;環(huán)丙沙星256～0.008μg/mL。
　

4、　 2.3單藥MIC測(cè)定將待檢菌分別配置0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙?，用MH肉湯中稀釋200倍（菌懸液中細(xì)菌的濃度大約為5.0×105cfu/mL）后取50μL加入各個(gè)孔中（此時(shí)各個(gè)藥物的終點(diǎn)濃度應(yīng)為放入MH肉湯菌液前濃度的1/2），混勻，37度放置18～24h，取出，測(cè)定待檢菌的每種藥物單獨(dú)MIC。同時(shí)做陰性、陽性對(duì)照以及標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)控。
　　 2.4聯(lián)合用藥孔板制備根據(jù)每種藥物的MIC設(shè)計(jì)棋盤方陣的各孔濃度，共8×8孔，藥物濃度范圍

5、是MIC的23倍到1/24倍。加藥時(shí)，橫排為A藥物，從左到右，濃度從高到低，豎排為B藥物，從上到下濃度從高到低，使得各孔中藥物濃度不一樣，初始放入濃度應(yīng)為最終濃度的4倍。然后每孔加入配好的藥物A藥和藥物B各25μL。
　　 2.5聯(lián)合用藥MIC測(cè)定在上述各孔中分別加入配好的含有待檢菌的MH肉湯50μL，混勻孵育18-24小時(shí)取出讀取各抗菌藥物對(duì)應(yīng)的MIC數(shù)值，同時(shí)做陰性對(duì)照、陽性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)控。
　　 2.6聯(lián)合用藥分

6、級(jí)抑菌濃度（Fractionalinhibitoryconcentration，F(xiàn)IC）指數(shù)按下列公式計(jì)算:FIC指數(shù)=A藥聯(lián)合的MIC/A藥單用的MIC+B藥聯(lián)合的MIC/B藥單用的MIC。結(jié)果解釋:FIC指數(shù)≤0.5為協(xié)同作用;0.5＜FIC指數(shù)＜4為無關(guān)作用;FIC指數(shù)≥4為拮抗作用。由于舒巴坦對(duì)銅綠假單胞菌天然耐藥，在計(jì)算FIC時(shí)不計(jì)舒巴坦。
　　 3.聯(lián)合殺菌曲線選用敏感菌株、MDR、XDR、PDR各2株，測(cè)定亞胺培南

7、、比阿培南分別聯(lián)合舒巴坦、頭孢哌酮、阿米卡星的殺菌益線。因舒巴坦對(duì)銅綠假單胞菌不敏感，測(cè)定濃度均為亞胺培南、比阿培南的相同濃度。結(jié)合我們預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，僅做0、8小時(shí)菌落計(jì)數(shù)。
　　 根據(jù)聯(lián)合用藥組菌落計(jì)數(shù)，較最有效的單藥組減少≥2.0log10CFU/mL時(shí)，可定義為協(xié)同，減少≤1.0log10CFU/mL時(shí)為無關(guān)作用，聯(lián)合后增加≥2.0log10CFU/mL時(shí)定義為拮抗。
　　 結(jié)果：
　　 1.K-B法單藥藥敏

8、120株P(guān)A中，敏感菌株數(shù)分別為:阿米卡星86、磷霉素63、環(huán)丙沙星61、頭孢他定66、頭孢哌酮64、頭孢哌酮/舒巴坦65、氨曲南67、哌拉西林/他唑巴坦64、亞胺培南83、比阿培南82、美羅陪南85、多粘菌素104。根據(jù)藥敏，敏感菌56株，MDR36株，XDR13株，PDR15株。
　　 2.K-B法聯(lián)合藥敏與比阿培南聯(lián)合最有效的依次為磷霉素（82株）、舒巴坦(51株)、阿米卡星（41株）、頭孢哌酮/舒巴坦（36株）;與亞胺培

9、南最有效的為磷霉素（82株）、舒巴坦(48株)、阿米卡星(44株);但亞胺培南與頭孢哌酮/舒巴坦(44株)、頭孢哌酮（68株）出現(xiàn)拮抗。碳青霉烯聯(lián)合舒巴坦對(duì)不同敏感性PA的的協(xié)同率無差異。
　　 3.聯(lián)合MIC測(cè)定聯(lián)合MIC法與K-B法結(jié)果基本一致。與亞胺培南、比阿培南聯(lián)合最有效的依次均為磷霉素(27株、42株)、阿米卡星（33株、31株）、舒巴坦（21株、22株）;但亞胺培南與頭孢哌酮（24株）或頭孢哌酮/舒巴坦（6株）出現(xiàn)拮

10、抗。結(jié)合與舒巴坦的結(jié)果分析，亞胺培南主要與頭孢哌酮產(chǎn)生拮抗。
　　 4.聯(lián)合殺菌曲線比阿培南:聯(lián)合舒巴坦協(xié)同8株，聯(lián)合阿米卡星協(xié)同8株，聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦協(xié)同4株，無關(guān)4株;聯(lián)合頭孢哌酮協(xié)同4株，無關(guān)4株。亞胺培南:聯(lián)合舒巴坦協(xié)同8株，聯(lián)合阿米卡星協(xié)同4株，無關(guān)4株，聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦拮抗4株，無關(guān)4株，聯(lián)合頭孢哌酮拮抗4株，無關(guān)4株。
　　 結(jié)論：
　　 1.與比阿培南聯(lián)合最有效的依次為磷霉素、舒巴坦、阿米

11、卡星、頭孢哌酮/舒巴坦;
　　 2.與亞胺培南最有效的為磷霉素、舒巴坦、阿米卡星;
　　 3.體外聯(lián)合藥敏發(fā)現(xiàn)，碳青霉烯類藥物聯(lián)合舒巴坦或磷霉素對(duì)于銅綠假單胞菌感染協(xié)同率最高，但亞胺培南與頭孢哌酮聯(lián)合有拮抗作用。
　　 第二部分
　　 地塞米松上調(diào)煙曲霉孢子侵襲力和A549細(xì)胞纖連蛋白表達(dá)
　　 目的：
　　 在體外環(huán)境中，比較煙曲霉孢子對(duì)受不同濃度地塞米松作用的A549細(xì)胞的侵襲力;探討

12、地塞米松對(duì)孢子侵襲力和A549細(xì)胞纖連蛋白表達(dá)量的影響。
　　 方法：
　　 (1)煙曲霉孢子侵襲力測(cè)定:分別用纖連蛋白抗體，不同濃度地塞米松預(yù)處理A549細(xì)胞后，將煙曲霉孢子侵襲A549細(xì)胞，4h后計(jì)數(shù)黏附在細(xì)胞表面和進(jìn)入細(xì)胞的孢子總數(shù)，并將其占總孢子數(shù)的比率計(jì)為侵襲力。
　　 (2)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(RT-PCR)檢測(cè)上述各地塞米松濃度預(yù)處理A549細(xì)胞24h后，細(xì)胞纖連蛋白基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平;應(yīng)用w

13、estern-blot和免疫組化技術(shù)檢測(cè)不同濃度地塞米松預(yù)處理48h后，細(xì)胞纖連蛋白的表達(dá)量。
　　 結(jié)果：
　　 (1)纖連蛋白抗體室溫下封閉處理細(xì)胞1h后，孢子對(duì)A549細(xì)胞的侵襲力較對(duì)照組下降24.8％,不同濃度地塞米松預(yù)處理A549細(xì)胞4h后，各組煙曲霉孢子的侵襲力無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05。而預(yù)處理24h后，25mg/L地塞米松組孢子侵襲力(24.66％±2.41％)高于對(duì)照組(19.17％±2.53％)組和1

14、mg/L(19.93％±3.06％)組，5mg/L(22.47％±2.46％)高于對(duì)照組，p＜0.05。25mg/L地塞米松預(yù)處理24h合并纖連蛋白抗體封閉1h后，孢子侵襲率無明顯下降。
　　 (2)RT-PCR細(xì)胞纖連蛋白基因轉(zhuǎn)錄相對(duì)表達(dá)量:25mg/L組細(xì)胞纖連蛋白基因轉(zhuǎn)錄相對(duì)表達(dá)量（9.19×103±1.2×10-3）高于對(duì)照組(4.61×10-3±1.54×10-3)和1mg/L組(6.20×10-3±1.93×10-3