RhoA-Rho kinase、Akt和UCH-L1在氟西汀抑制野百合堿誘導的肺動脈高壓作用中的機制探討.pdf

1、前言：
　　 肺動脈高壓的主要特征包括肺動脈壓力升高、肺血管收縮、肺血管重構(gòu)以及炎癥反應(yīng)等,最終導致右心衰竭,甚至死亡。肺動脈高壓患者血漿中5-羥色胺濃度顯著增加。5-羥色胺通過5-羥色胺轉(zhuǎn)運體(serotonintransporter,5-HTT)的轉(zhuǎn)運激活下游信號通路,刺激肺動脈平滑肌細胞的增殖,從而誘導肺動脈重構(gòu)。我們以前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn):5-羥色胺轉(zhuǎn)運體抑制劑氟西汀(fluoxetine)對5-羥色胺誘導的肺動脈平滑肌細胞

2、增殖有抑制作用;5-羥色胺轉(zhuǎn)運體抑制劑氟西汀或舍曲林(sertraline)通過降低肺動脈壓力、減輕右心室肥厚、緩解肺動脈重構(gòu)或者改善肺組織炎癥來抑制肺動脈高壓。但是,氟西汀抑制肺動脈高壓的機制還有待完善。
　　 研究表明,小GTP酶Ras同源基因家族成員A(thesmallGTPaseRashomologgenefamilymemberA.RhoA)和它的下游效應(yīng)器Rho激酶在肺動脈高壓形成過程中具有重要的作用。與對照組相比,

3、特發(fā)性肺動脈高壓患者的肺組織和血小板中RhoA的5.羥色胺化顯著增加。SM22-5-HTT+轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織中的RhoA5-羥色胺化水平也明顯高于對照組小鼠。在特發(fā)性肺動脈高壓患者和其對照組肺動脈平滑肌細胞中,氟西汀抑制5-羥色胺誘導的RhoA5-羥色胺化,也抑制5-羥色胺誘導的RhoA活性增加。
　　 在肺動脈高壓大鼠模型中,肺組織和肺動脈的蛋白激酶B(proteinkinaseB,Akt)活性顯著增加。Akt的激活參與5-羥

4、色胺誘導的肺動脈平滑肌細胞增殖和遷移過程,是5-羥色胺刺激肺動脈平滑肌細胞有絲分裂的重要環(huán)節(jié)。5-羥色胺增加肺動脈平滑肌細胞[3H]胸腺嘧啶摻入,選擇性Akt抑制劑NL-71-101降低5-羥色胺誘導的這一改變。而且,5-羥色胺誘導血管平滑肌細胞Akt延遲性激活被氟西汀所阻斷。
　　 另外,核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nucleartranscriptionfactor-κB,NF-κB)激活對肺動脈高壓,炎癥和血管重構(gòu)產(chǎn)生重要作用。通常

5、,它與核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制蛋白-α相連,以失活形式存在于細胞質(zhì)中。泛素.蛋白酶體系統(tǒng)降解核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制蛋白-α,使NF-κB與其分離,產(chǎn)生活性。泛素羧基末端水解酶1(ubiquitincarboxyl-terminalesteraseL1,UCH-L1)反向調(diào)節(jié)泛素-蛋白酶體系統(tǒng),防止核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制蛋白-α降解,抑制NF-κB激活。過度表達的UCH-L1通過抑制炎癥、降低NF-κB活性來對抗血管重構(gòu)。而且,UCH-L1負向調(diào)

6、節(jié)腫瘤壞死因子-α介導的血管平滑肌細胞增殖和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularregulatedproteinkinase,ERK)激活。
　　 但是,氟西汀抑制野百合堿誘導的肺動脈高壓是否與RhoA/Rho激酶、Akt以及UCH-L1有關(guān)均不清楚。因此,本研究建立野百合堿誘導的肺動脈高壓模型,通過對RhoA/Rho激酶信號通路、Akt以及UCH-L1等相關(guān)指標的檢測來探討氟西汀對抗野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓的機制

7、。
　　 實驗材料與方法：
　　 建立野百合堿誘導的慢性炎性肺動脈高壓大鼠模型:把雄性Wistar大鼠隨機分為4組,對照組、野百合堿組、氟西汀低劑量組和氟西汀高劑量組;野百合堿組、氟西汀低劑量組和氟西汀高劑量組大鼠一次性腹腔內(nèi)注射野百合堿60mg·kg-1;注射后,氟西汀低劑量組和氟西汀高劑量組大鼠分別灌胃給予氟西汀2mg·kg-1·d-1和10mg·kg-1·d-1,給藥三周。之后,檢測血液動力學、右心肥厚指數(shù)等指標;

8、用病理染色的方法檢測肺小動脈血管壁改變與肺組織炎癥;用westernblot方法檢測5-HTT、Akt、RhoA、ROCK2、ERK、UCH-L1的表達以及Akt、ERK、RhoA、NF-κB的活性;用免疫組化方法檢測ROCK2的表達;用免疫共沉淀方法檢測RhoA和5-羥色胺的相互作用;用RT-PCR方法檢測UCH-L1mRNA的變化;用統(tǒng)計分析的方法,分別比較以上不同組別之間各項指標的差異,探討氟西汀對抗野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓機

9、制。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1、氟西汀抑制野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠肺動脈壓和右心室肥厚
　　 成功建立慢性炎性肺動脈高壓大鼠模型。與對照組比較,野百合堿組大鼠平均肺動脈壓力顯著升高,氟西汀高劑量組顯著降低了野百合堿誘導的肺動脈壓力。與對照組相比,野百合堿組大鼠右心肥厚指數(shù)明顯增加,而氟西汀劑量依賴性地抑制了野百合堿誘導的右心室肥厚。
　　 2、氟西汀劑量依賴性地抑制肺動脈重構(gòu)
　　 野百合堿

10、組肺動脈血管壁厚度比對照組明顯增厚。氟西汀劑量依賴性地抑制了肺動脈血管壁增厚。野百合堿組肺動脈血管壁面積與對照組相比明顯增加。氟西汀劑量依賴性地減少肺動脈血管壁面積。這表明氟西汀劑量依賴性地抑制野百合堿誘導的大鼠肺動脈重構(gòu)。
　　 3、氟西汀抑制肺動脈和肺組織5-HTT、RhoA、ROCK2蛋白表達
　　 野百合堿組肺動脈和肺組織中的5-HTT、RhoA、ROCK2表達顯著增加,氟西汀劑量依賴性地降低了野百合堿誘導的大鼠

11、肺動脈和肺組織5-HTT、RhoA、ROCK2的過度表達。
　　 4、氟西汀降低肺組織RhoA的膜易位和5-羥色胺化水平
　　 野百合堿組肺組織中的RhoA膜易位顯著增加,高劑量的氟西汀顯著抑制野百合堿誘導的大鼠肺組織中增加的RhoA膜易位。野百合堿組肺組織中的RhoA的5-羥色胺化水平明顯升高,氟西汀使野百合堿誘導的大鼠肺組織中RhoA的5-羥色胺化恢復到正常水平。這表明氟西汀抑制野百合堿誘導的大鼠肺組織中RhoA的激

12、活。
　　 5、氟西汀抑制肺動脈和肺組織中Akt、ERK的激活
　　 野百合堿組肺動脈和肺組織中的Akt、ERK磷酸化顯著增加,氟西汀劑量依賴性地降低了野百合堿誘導的大鼠肺動脈和肺組織中Akt、ERK的磷酸化。這表明氟西汀抑制野百合堿誘導的大鼠肺動脈和肺組織中Akt、ERK的激活。
　　 6、氟西汀抑制肺動脈周圍和肺組織炎癥
　　 與對照組相比,野百合堿組肺組織結(jié)構(gòu)不清晰,血管周圍和肺組織中有大量炎性細胞

13、浸潤。氟西汀低劑量組對血管周圍及肺組織炎性細胞改善不明顯。氟西汀高劑量組顯著減少血管周圍炎性細胞,改善肺組織結(jié)構(gòu)。
　　 7、氟西汀增加野百合堿誘導的肺組織泛素羧基末端水解酶1蛋白表達水平
　　 野百合堿組肺組織中的UCH-L1表達明顯降低,氟西汀劑量依賴性地提高野百合堿誘導的大鼠肺組織UCH-L1的表達。各組之間大鼠肺動脈UCH-L1的mRNA和蛋白表達沒有顯著性差異。
　　 8、氟西汀降低野百合堿誘導的肺組織

14、NF-κB核易位水平
　　 野百合堿明顯提高大鼠肺組織NF-κB核易位水平,氟西汀高劑量組顯著降低了NF-κB核易位水平。
　　 結(jié)論：
　　 1、氟西汀通過對野百合堿誘導的慢性炎性肺動脈高壓大鼠肺動脈和肺組織中5-HTT表達的抑制,降低肺動脈壓力、緩解肺動脈重構(gòu)以及改善右心室肥厚,并且這一過程與抑制RhoA/Rho激酶信號通路有關(guān)。
　　 2、氟西汀抑制野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓與抑制Akt和ERK激