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文檔簡介
1、慢性髓系白血病(CML)是一種起源于造血干細胞的惡性克隆性疾病,其特征性遺傳學標志是由染色體易位形成費城(Ph)染色體。由易位染色體產生的Bcr-Ab1融合基因編碼產生分子量為210kD的Bcr-Ab1融合蛋白,最初在造血干細胞中表達,促進骨髓及淋巴樣細胞的分化,具有異常增高的蛋白酪氨酸激酶活性,被認為是CML發(fā)病的始發(fā)因素。
傳統(tǒng)的CML的治療采用羥基脲、馬利蘭、甲異靛及干擾素等藥物療效欠佳且副作用大。隨著對Bcr-Ab
2、1蛋白活性的深入研究,使其成為CML治療的重要的分子靶點。伊馬替尼(Imatinib)作為小分子Bcr-Ab1酪氨酸激酶抑制劑以其顯著的療效及毒副作用低的特點,成為目前CML治療的一線用藥。但隨著臨床用藥的增加Imatinib耐藥問題逐漸突顯。另外,Imatinib不能根除殘留的白血病干細胞及原始祖細胞,成為疾病復發(fā)的危險因素。因此尋找新靶點或多靶點藥物成為CML研究的熱點。
臨床上常見的獲得性Imatinib耐藥機制主要
3、分為兩類:Bcr-Ab1依賴型及Bcr-Ab1非依賴型。Bcr-Ab1依賴型耐藥中主要原因為Bcr-Ab1基因發(fā)生位點突變以及擴增引起的表達增加。另外,從Immatnib耐藥的患者中分離的細胞系中發(fā)現(xiàn)Src激酶家族(SFK)成員中Lyn及Hck過表達,提示SFK涉及Bcr-Ab1非依賴型Imatinib耐藥。由于Ab1與SFK成員中具有明顯的序列同源性及活性中心結構相似性。因此,在對多種不同化學結構的Src激酶抑制劑的研究中包括Bosu
4、tinib、Dasatinib及INNO-0406等,發(fā)現(xiàn)這些化合物能夠較Imatinib更有效地抑制Bcr-Ab1激酶活性,并且對多種位點突變的Bcr-Ab1有效。
FB2是一種新型的噻唑類衍生物,前期研究已經(jīng)證實其可有效地抑制Imatinib敏感及無Bcr-Ab1點突變的耐藥K562細胞系。本研究將觀察FB2對Imatinib耐藥的具有Ab1激酶點突變的Ba/F3P210(WT、Y253F及T315I)白血病細胞的作用
5、及機制,并建立四種不同的動物模型Ph+的K562及體外建立的Imatinib耐藥株K562/G7.0NOD/SCID小鼠模型,Ba/F3P210(WT及Y253)白血病小鼠模型,以觀察FB2對不同耐藥機制動物模型中位生存期的影響。
基于FB2是在Dasatinib的結構基礎上優(yōu)化改造,推測其與Ab1結合不會像Imatinib對蛋白結構要求嚴格,因此本實驗首先純化野生型(WT)及具有突變位點(Y253F及T315I)的Ab1
6、激酶區(qū),利用Histone2B作為Ab1激酶的底物,結果顯示FB2在納摩爾水平能夠有效地抑制Ab1(WT及Y253F)激酶活性,而對T315I突變的Ab1無效。同時進一步檢測了FB2對Src及Lyn的體外激酶活性抑制作用,結果顯示其對激酶活性的IC50值分別為1.37nmol/L和2.83nmol/L。
此后,采用Ba/F3P210細胞系包括野生型及兩株具有突變位點Y253F及T315I的細胞觀察FB2對細胞增殖的影響。M
7、TT結果顯示,F(xiàn)B2明顯抑制Ba/F3P210WT及Y253F細胞(IC50分別為1.30nmol/L,2.56nmol/L)的生長,對Ba/F3P210T315I無效。另外,為進一步探討FB2抗Imatinib耐藥的作用機制,對細胞內Bcr-Ab1、c-Src和Lyn蛋白的磷酸化水平進行檢測,結果與體外活性測定一致,F(xiàn)B2能夠明顯抑制Ba/F3P210WT及Y253F細胞Bcr-Ab1、c-Src和Lyn蛋白的自身磷酸化水平,但對Ba
8、/F3P210T315I細胞僅能抑制c-Src和Lyn蛋白活性。同時在對細胞周期的影響的研究中發(fā)現(xiàn),F(xiàn)B2在納摩爾水平可使Ba/F3P210(WT、Y253F)細胞發(fā)生G0/G1期阻滯,將藥物濃度增加至微摩爾水平能增加Ba/F3P210T3151細胞G0/G1期細胞比例。
最后,通過尾靜脈注射不同類型CML細胞株建立白血病動物模型評價FB2治療CML的作用。無藥物處理的對照組小鼠很快發(fā)展為白血病小鼠,生存期在27~75天,
9、FB2可以明顯延長包括K562敏感株、Lyn激酶過表達的K562/G7.0耐藥株、Ba/F3P210野生株及Imatinib耐藥Y253F點突變株,四種不同白血病小鼠模型的生存期,且具有良好的劑量效應關系。在動物實驗觀察周期均在三個月以上,F(xiàn)B2治療組動物對藥物耐受性均較好,無體重下降現(xiàn)象出現(xiàn),一定程度上反映了該藥毒副作用小的特點。
綜上,F(xiàn)B2作為一種酪氨酸激酶抑制劑,具有明確的Bcr-Ab1及Src激酶抑制作用,可能成
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