羥氯喹對(duì)酪氨酸激酶抑制劑耐藥慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的作用和機(jī)制研究.pdf

1、第一章羥氯喹增強(qiáng)酪氨酸激酶抑制劑對(duì)T315I突變細(xì)胞的殺傷作用
　　背景:
　　T315I是最常見的BCR-ABL激酶區(qū)點(diǎn)突變，該突變?cè)斐葿CR-ABL融合蛋白第315位蘇氨酸被異亮氨酸取代，引起融合蛋白的構(gòu)象和功能發(fā)生變化，是造成CML多藥耐藥的重要原因。帶有BCR-ABLT315I突變的CML對(duì)伊馬替尼、達(dá)沙替尼、尼羅替尼和博舒替尼等多種TKIs耐藥，第三代TKIs-博納替尼是目前治療T315I突變CML的一線藥物，另外

2、有文獻(xiàn)報(bào)道血管表皮生長因子受體抑制劑—阿西替尼也可以在體外殺傷T315I突變的CML細(xì)胞。在藥物壓力下腫瘤細(xì)胞可以通過“自噬”來維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)避免細(xì)胞凋亡，因此“自噬”是腫瘤細(xì)胞對(duì)抗藥物殺傷的利器。伊馬替尼通過抑制BCR-ABL的激酶活性在殺傷CML細(xì)胞的同時(shí)也誘導(dǎo)了CML細(xì)胞自噬，自噬在一定程度上削弱了伊馬替尼的殺傷作用。在伊馬替尼治療的同時(shí)，利用自噬抑制劑羥氯喹(HCQ)抑制CML細(xì)胞自噬可以顯著增強(qiáng)伊馬替尼的抗腫瘤作用。在T315

3、I突變CML細(xì)胞中，阿西替尼、博納替尼能否誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，自噬是否為T315I突變CML細(xì)胞逃避藥物殺傷的一種機(jī)制，自噬抑制劑羥氯喹(HCQ)能否增強(qiáng)阿西替尼、博納替尼對(duì)T315I突變CML細(xì)胞的殺傷作用目前尚無報(bào)道。
　　目的:
　　研究自噬抑制劑羥氯喹(HCQ)是否能夠增強(qiáng)阿西替尼、博納替尼對(duì)32Dp210-T315I細(xì)胞的殺傷，并進(jìn)一步揭示HCQ的作用機(jī)制，為T315I突變CML的治療提供思路和方向，為推動(dòng)HCQ聯(lián)合TK

4、Is在耐藥CML治療中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　以穩(wěn)定表達(dá)BCR-ABLT315I的32D細(xì)胞（32Dp210-T315I細(xì)胞）為主要研究對(duì)象，利用Western Blot檢測(cè)LC3Ⅱ的表達(dá)、利用共聚焦免疫熒光顯微鏡觀察自噬小體，分析阿西替尼、博納替尼是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。檢測(cè)HCQ能否抑制阿西替尼、博納替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，并比較阿西替尼、博納替尼聯(lián)合/不聯(lián)合HCQ處理后32Dp210-T315I細(xì)胞的凋亡（流式檢測(cè)

5、AnnexinⅤ/7AAD）、克隆形成（在半固態(tài)的甲基纖維素培養(yǎng)液中進(jìn)行7天的克隆形成實(shí)驗(yàn)）、周期（細(xì)胞固定/破膜后經(jīng)PI染色，并采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)）及細(xì)胞衰老（衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色），分析HCQ是否能夠增強(qiáng)阿西替尼、博納替尼對(duì)32Dp210-T315I細(xì)胞的殺傷作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證HCQ是否通過抑制自噬發(fā)揮作用，利用shRNA敲降自噬蛋白ATG7來抑制細(xì)胞自噬，阿西替尼、博納替尼處理ATG7敲降和未敲降的32Dp210-T315

6、I細(xì)胞后比較細(xì)胞的凋亡和周期，分析抑制自噬是否增強(qiáng)了阿西替尼、博納替尼在T315I突變CML治療中的作用。采用32Dp210-T315I細(xì)胞建立裸鼠皮下成瘤的模型，比較阿西替尼單藥治療和HCQ聯(lián)合阿西替尼治療對(duì)小鼠腫瘤的抑制作用。
　　結(jié)果:
　　阿西替尼、博納替尼誘導(dǎo)32Dp210-T315I細(xì)胞自噬。HCQ抑制了阿西替尼、博納替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，并且增強(qiáng)了阿西替尼、博納替尼誘導(dǎo)的32Dp210-T315I細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)阿

7、西替尼、博納替尼對(duì)細(xì)胞克隆形成的抑制作用;但并不能增強(qiáng)阿西替尼、博納替尼誘導(dǎo)的32Dp210-T315I細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞衰老。靶向ATG7的shRNA可以有效敲降A(chǔ)TG7蛋白的表達(dá)，并抑制了阿西替尼、博納替尼誘導(dǎo)的32Dp210-T315I細(xì)胞自噬。與HCQ的作用相似，ATG7蛋白敲降增強(qiáng)了阿西替尼、博納替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，對(duì)阿西替尼、博納替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯無影響。
　　結(jié)論:
　　HCQ通過抑制自噬增強(qiáng)了阿西替尼、博

8、納替尼對(duì)32Dp210-T315I細(xì)胞的殺傷作用。
　　第二章羥氯喹促進(jìn)NKG2D-ULBP4介導(dǎo)的Vγ9Vδ2 T殺傷酪氨酸激酶抑制劑耐藥的CML細(xì)胞
　　背景:
　　通過靶向自噬HCQ不僅可以提高多種藥物的抗腫瘤作用，還可以有效促進(jìn)腫瘤的免疫清除，抑制低氧誘導(dǎo)的自噬可以提高肺癌細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷作用的敏感性，抑制黑色素瘤細(xì)胞自噬也可以促進(jìn)CTL殺傷黑色素瘤細(xì)胞，抑制自噬也可以增強(qiáng)IL2及某些腫瘤疫苗的治療作用。免疫

9、治療已經(jīng)成為白血病治療的趨勢(shì)，Vγ9Vδ2 T細(xì)胞是一種具有很強(qiáng)腫瘤殺傷能力的免疫細(xì)胞，甚至可以有效殺傷TKIs耐藥的CML細(xì)胞，是細(xì)胞免疫治療的“明日之星”。本部分旨在研究HCQ是否能夠促進(jìn)Vγ9Vδ2 T細(xì)胞殺傷TKIs耐藥的CML細(xì)胞，并揭示其作用機(jī)制。
　　目的:
　　探索自噬抑制劑—羥氯喹(HCQ)是否能夠增強(qiáng)Vγ9Vδ2 T細(xì)胞對(duì)TKIs耐藥CML細(xì)胞的殺傷，并進(jìn)一步揭示其作用機(jī)制，為推動(dòng)HCQ聯(lián)合Vγ9Vδ2

10、T細(xì)胞免疫治療在TKIs耐藥CML治療中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　以K562/GO1細(xì)胞（人CML伊馬替尼耐藥株）和K562細(xì)胞（人CML伊馬替尼敏感株）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅱ、P62的表達(dá)、透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體的數(shù)量，分析HCQ對(duì)細(xì)胞的自噬抑制作用。以HCQ預(yù)處理的K562/GO1細(xì)胞和K562細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組靶細(xì)胞，PBS預(yù)處理的K562/GO1細(xì)胞和K562細(xì)胞為對(duì)照

11、組靶細(xì)胞;以健康志愿者外周血來源的Vγ9Vδ2T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞。將CML細(xì)胞株與Vγ9Vδ2 T細(xì)胞以不同的效靶比共培養(yǎng)進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)，比較實(shí)驗(yàn)組靶細(xì)胞和對(duì)照組靶細(xì)胞對(duì)Vγ9Vδ2 T細(xì)胞敏感性的差別。靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞以1∶1的效靶比共培養(yǎng)4h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Vγ9Vδ2 T細(xì)胞的脫顆粒水平，分析不同靶細(xì)胞誘發(fā)Vγ9Vδ2 T細(xì)胞脫顆粒的差異，并利用CML患者來源的白血病細(xì)胞作為靶細(xì)胞再次驗(yàn)證脫顆粒實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。采用shRNA敲降A(chǔ)TG7

12、蛋白抑制細(xì)胞自噬，檢測(cè)抑制自噬是否能夠增強(qiáng)CML細(xì)胞對(duì)Vγ9Vδ2 T細(xì)胞殺傷作用的敏感性，并檢測(cè)HCQ是否能夠增強(qiáng)ATG7敲降的CML細(xì)胞對(duì)Vγ9Vδ2 T細(xì)胞的敏感性，分析HCQ是否通過抑制自噬發(fā)揮增敏作用。流式細(xì)胞儀檢測(cè)PBS或HCQ處理對(duì)CML細(xì)胞表面NKG2DL(MICA/B、ULBP1-6)表達(dá)的影響，并利用NKG2D阻斷性抗體阻斷Vγ9Vδ2 T細(xì)胞表面NKG2D與CML細(xì)胞表面NKG2DL的相互識(shí)別，分析誘導(dǎo)ULBP4（

13、一種NKG2DL）在CML細(xì)胞膜表達(dá)是否為HCQ增強(qiáng)CML細(xì)胞對(duì)Vγ9Vδ2 T細(xì)胞敏感性的機(jī)制。通過WesternBlot、熒光定量PCR、流式細(xì)胞儀檢測(cè)ULBP4的表達(dá)，共聚焦免疫熒光顯微鏡檢測(cè)ULBP4在細(xì)胞內(nèi)的分布揭示HCQ促進(jìn)ULBP4表達(dá)的機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　HCQ可以有效阻斷K562/GO1細(xì)胞和K562細(xì)胞自噬，并且增強(qiáng)了K562/GO1和K562細(xì)胞對(duì)Vγ9Vδ2 T殺傷作用的敏感性。但敲降A(chǔ)TG7蛋白

14、阻斷細(xì)胞自噬并不能模擬HCQ的增敏作用，即使在ATG7敲降的K562/GO1和K562細(xì)胞中HCQ依舊可以提高Vγ9Vδ2 T對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，提示HCQ的增敏作用并不依賴于抑制腫瘤細(xì)胞自噬。HCQ誘導(dǎo)了ULBP4在K562/GO1和K562細(xì)胞膜表達(dá)，阻斷NKG2D與NKG2DL的相互識(shí)別后HCQ的增敏作用幾乎消失，提示誘導(dǎo)ULBP4在CML細(xì)胞表面表達(dá)是HCQ促進(jìn)Vγ9Vδ2 T殺傷CML細(xì)胞的關(guān)鍵。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HCQ并沒有提