甲苯噻嗪對(duì)超級(jí)化激活的環(huán)腺苷酸門控陽離子通道影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 建立膜片嵌實(shí)驗(yàn)中適于記錄超極化激活環(huán)核苷酸門控(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated，HCN)陽離子通道產(chǎn)生的超極化激活電流(hyperpolarization-activated currents，Ih)[1]的方法，重組HCN1基因PCE-HCN1質(zhì)粒DNA，重組HCN2基因PCE-HCN2質(zhì)粒DNA經(jīng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染經(jīng)培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞，HEK29

2、3細(xì)胞表達(dá)HCN離子通道，研究甲苯噻嗪對(duì)HCN1離子通道，HCN2離子通道的影響。
　　 方法：
　　 重組HCN1質(zhì)粒DNA或重組的HCN2質(zhì)粒DNA經(jīng)脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HCN1或HCN2離子通道的細(xì)胞模型，選取細(xì)胞表面光滑，貼壁良好，圓形的細(xì)胞進(jìn)行電生理實(shí)驗(yàn)。首先按預(yù)先設(shè)定的刺激方案來干預(yù)細(xì)胞，誘導(dǎo)出Ih電流，然后分別給予12.5um/L甲苯噻嗪，25um/L甲苯噻嗪，50um/L甲苯噻嗪，100

3、um/L甲苯噻嗪，記錄甲苯噻嗪對(duì)HCN1和HCN2離子通道動(dòng)力學(xué)的影響，得到Ⅰ-Ⅴ曲線，通道的激活曲線，統(tǒng)計(jì)甲苯噻嗪對(duì)HCN1離子通道和HCN2離子通道電流抑制幅度；并計(jì)算出甲苯噻嗪對(duì)HCN1V1/2和HCN2V1/2(V1/2是離子通道激活50％時(shí)的膜電位)電壓的偏移；計(jì)算出不同溶度的甲苯噻嗪在生理電壓下(-90mv)對(duì)HCN1和HCN2通道電流的抑制率，同時(shí)對(duì)比相同濃度下甲苯噻嗪對(duì)HCN離子通道不同亞型HCN1與HCN2離子通道的敏

4、感性。
　　 結(jié)果：
　　 經(jīng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞能產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)HCN1或HCN2離子通道的細(xì)胞模型，細(xì)胞質(zhì)量好，形態(tài)結(jié)構(gòu)規(guī)則，有60個(gè)細(xì)胞成功的記錄到Ih電流并最終完成全部實(shí)驗(yàn)。甲苯噻嗪在不同的濃度下減小了HCN1的電流，使得HCN1的Ⅰ-Ⅴ曲線上移，甲苯噻嗪在12.5um/1到100um/L的臨床濃度范圍內(nèi)，使得HCN1V1/2從-83.31±2.74mv向-99.83±5.08mv偏移(n=6，p<0.05)，

5、我們發(fā)現(xiàn)在正常生理?xiàng)l件電壓下(-90mv)，甲苯噻嗪在12.5um/l到100um/L的臨床濃度范圍內(nèi)抑制了HCN1電流幅度分別為9％±0.06到42％±0.16(n=6，p<0.05)。有趣的是，甲苯噻嗪不但抑制了HCN1通道而且對(duì)HCN2離子通道也很敏感，使得HCN2的Ⅰ-Ⅴ曲線上移，使得HCN2V1/2從-98.55±3.93mv向-110.65±3.78mv偏移(n=6，p<0.05)，同時(shí)甲苯噻嗪在正常生理?xiàng)l件電壓下(-90m

6、v)12.5um/l到100um/L的臨床濃度范圍內(nèi)也抑制了HCN2電流幅度分別為27%±0.05到70%±0.11(n=6，p<0.05)。甲苯噻嗪在正常生理?xiàng)l件電壓下(-90mv)與相同的濃度范圍內(nèi)分別作用HCN離子通道不同亞基HCN1與HCN2離子通道，發(fā)現(xiàn)甲苯噻嗪對(duì)HCN2離子通道的作用更敏感。
　　 結(jié)論：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞能構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的HCN離子通道，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞存活率高，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞表面光滑，能夠用于