帕金森病相關(guān)基因的篩選及生物信息學(xué)分析.pdf

1、帕金森病(Parkinson's disease，PD)是中老年人常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是我國(guó)第二大神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病，帕金森病的病理改變是中腦黑質(zhì)多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元變性、胞漿內(nèi)Lewy小體的形成，使黑質(zhì)紋狀體通路破壞及尾狀核、殼核中DA含量減少。其主要的臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、行動(dòng)遲緩和姿勢(shì)步態(tài)異常。隨著人們對(duì)該病的認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)全世界PD的發(fā)病人數(shù)逐年增多，加之人口的老齡化，其

2、患病率呈上升趨勢(shì)。國(guó)內(nèi)外流行病學(xué)研究表明:65歲以上人群中發(fā)病率是1～2％，85歲以上高達(dá)4～5％，55歲以上PD患者總?cè)藬?shù)已超過(guò)170萬(wàn)人。隨著社會(huì)人口的自然老齡化，PD的患病人數(shù)逐年增加，我國(guó)的患病人數(shù)已超過(guò)200萬(wàn)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)嗅覺(jué)障礙、睡眠障礙、精神障礙、認(rèn)知障礙，以及自主神經(jīng)功能障礙等普遍存在于PD患者中，而且出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)癥狀的不同時(shí)期，同樣影響著患者的生存質(zhì)量。PD雖然不會(huì)縮短患者壽命，但與阿爾茨海默病(Alzheimer

3、'sDisease，AD)一樣嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，以及因其病程長(zhǎng)、致殘率高等特點(diǎn)，給患者和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)及煩惱。因此，研究帕金森病的病因和發(fā)病機(jī)制具有極其重要的意義。
　　帕金森病的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為是在年齡老化的背景上，遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。許多研究提示PD患者黑質(zhì)DA能神經(jīng)元變性可能與線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、興奮性毒性、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏、免疫調(diào)節(jié)異常、細(xì)胞調(diào)亡等一系列機(jī)制、環(huán)節(jié)有關(guān)，流行病學(xué)

4、調(diào)查研究顯示，約有10～15％的帕金森病患者有家族史。通過(guò)對(duì)遺傳因素在PD發(fā)病中的作用機(jī)理研究，目前至少克隆了13個(gè)PD致病基因，表明帕金森病的發(fā)病與遺傳因素密切相關(guān)，而遺傳因素包含了多基因、多因子的相互作用和影響。因而從分子水平研究帕金森病的發(fā)生發(fā)展，對(duì)于它的預(yù)防、控制和治療具有重要意義。
　　微小RNA(microRNA，miRNAs)是一類在細(xì)胞中高度保守的、內(nèi)源性非編碼、長(zhǎng)度約22～25核苷酸(nt)的單鏈小RNA分子。由

5、一段長(zhǎng)度為70-80nt并具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈miRNA前體剪切后生成。其廣泛存在于真核生物中，主要是與靶mRNA的3'端非翻譯調(diào)控區(qū)（3'-untransltated region，3'UTR）互補(bǔ)或者部分互補(bǔ)結(jié)合，使其降解或介導(dǎo)翻譯抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，具有組織和時(shí)間的特異性，是調(diào)節(jié)其他功能基因表達(dá)的重要調(diào)控分子。miRNAs參與了生命過(guò)程中的許多重要事件，如胚胎的早期發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡以及代謝、腫瘤

6、轉(zhuǎn)移等。
　　基因芯片是20世紀(jì)90年代中期以來(lái)隨著人類基因組計(jì)劃快速發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)高新技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于疾病基因表達(dá)譜分析、尋找疾病相關(guān)基因、藥物作用靶標(biāo)、腫瘤預(yù)后、復(fù)雜疾病的致病機(jī)制分析等方面，為個(gè)體化診斷和治療提供指導(dǎo)，也可以揭示基因間的表達(dá)調(diào)控關(guān)系，同時(shí)它在制藥和臨床研究中也有重要的作用?；蛐酒峁┝税ɑ蚬δ?、基因相互作用等海量信息，這些數(shù)據(jù)為功能基因組研究提供了重要的資源，GEO、SMD、ArrayExpre

7、ss等數(shù)據(jù)庫(kù)在基因芯片的歸類、儲(chǔ)存、資源共享等方面提供有利幫助。數(shù)據(jù)是知識(shí)和信息的重要來(lái)源，對(duì)于這些數(shù)據(jù)已經(jīng)無(wú)法通過(guò)簡(jiǎn)單的計(jì)算和分析來(lái)進(jìn)行，因此，如何采用一些新的方法和技術(shù)來(lái)有效分析這些龐大的基因芯片，并從中挖掘和揭示蘊(yùn)藏的、有意義的生物學(xué)信息，是當(dāng)前基因芯片領(lǐng)域亟待解決的重要課題。
　　生物信息學(xué)(Bioinformatics)是伴隨著人類基因組計(jì)劃發(fā)展而產(chǎn)生的一門涉及生物學(xué)、數(shù)學(xué)以及計(jì)算機(jī)科學(xué)的交叉學(xué)科。生物信息學(xué)是融合生命科

8、學(xué)與數(shù)理科學(xué)的新興學(xué)科，具體地說(shuō)生物信息學(xué)是以核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子數(shù)據(jù)庫(kù)為主要研究對(duì)象，以數(shù)學(xué)、信息學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)為主要研究手段，對(duì)海量的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行存儲(chǔ)、管理、注釋、加工。
　　隨著近年來(lái)生物實(shí)驗(yàn)方法和檢測(cè)數(shù)據(jù)的發(fā)展，積累了大量分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過(guò)對(duì)這些數(shù)據(jù)的分類、收集、整理，產(chǎn)生了成千上萬(wàn)的數(shù)據(jù)庫(kù)。數(shù)據(jù)庫(kù)是生物信息學(xué)的主要內(nèi)容，各種數(shù)據(jù)庫(kù)幾乎覆蓋了生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。常用的有核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，如NCBI的核酸序列數(shù)據(jù)

9、庫(kù)、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(UniProt)等;基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)，如高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO);疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，如GeneCards(基因卡片)、藥物和疾病數(shù)據(jù)庫(kù)(DrugBank)等。目前，生物信息學(xué)已廣泛地滲透到生命科學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域中，成為不可或缺的重要工具，在人類疾病與功能基因的發(fā)現(xiàn)、識(shí)別，基因與蛋白質(zhì)的功能研究方面都發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，如基因表達(dá)調(diào)控、疾病相關(guān)基因鑒定、基因產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)、癌癥的遺傳機(jī)制研究等。
　　本研究以G

10、EO數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于帕金森病的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)和microRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)為分析材料，利用Qlucore Omics Explorer3.0軟件篩選基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)GSE22491（帕金森病樣本10例，正常對(duì)照組樣本8例）的差異表達(dá)基因和miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)GSE16658（帕金森病樣本19例，正常對(duì)照組樣本13例）的差異表達(dá)miRNA，通過(guò)miRecords預(yù)測(cè)差異miRNA的靶基因，利用DAVID、KEGG、STRING等在線分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)

11、集GSE22491差異基因和數(shù)據(jù)集GSE16658差異miRNA靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為帕金森病的分子發(fā)病機(jī)制、藥物研發(fā)及治療提供有意義的探索和依據(jù)。
　　根據(jù)設(shè)定的數(shù)值過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)和中位值標(biāo)準(zhǔn)化處理后，基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)GSE22491經(jīng)QOE3.0軟件篩選出1752個(gè)差異基因，其中上調(diào)1561個(gè)，下調(diào)191個(gè)。通過(guò)DAVID生物學(xué)過(guò)程分析表明，差異表達(dá)的基因主要涉及蛋白質(zhì)的翻譯、翻譯延伸、代謝前體、信使核糖核酸代謝過(guò)程、電子傳遞鏈

12、、RNA和mRNA的修飾、泛素依賴蛋白酶體促進(jìn)蛋白質(zhì)分解代謝、泛素蛋白連接酶對(duì)有絲分裂過(guò)程中細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控過(guò)程等;分子功能表明，差異表達(dá)的基因主要涉及核糖體的結(jié)構(gòu)成分、RNA復(fù)合物、活性結(jié)構(gòu)分子、作用于NADH或NADPH的氧化還原酶活性，NADH脫氫酶活性、氫離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性、氧化還原酶活性，作用于NADH或NADPH醌或類似化合物受體、陽(yáng)離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性等。通過(guò)KEGG分析發(fā)現(xiàn)，這些差異基因主要參與核糖體信號(hào)通路、帕金森病信號(hào)通路

13、、氧化磷酸化信號(hào)通路、亨廷頓病信號(hào)通路、阿爾茨海默病信號(hào)通路、蛋白酶體信號(hào)通路、心臟肌肉收縮信號(hào)通路、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂信號(hào)、霍亂弧菌感染信號(hào)通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移信號(hào)通路、磷酸戊糖途徑信號(hào)通路、檸檬酸信號(hào)通路、FcγR介導(dǎo)的吞噬通路等。通過(guò)QOE3.0軟件的進(jìn)一步篩選得到101個(gè)差異表達(dá)比較大的基因，將這101個(gè)基因上傳至STRING在線工具，分析這些基因編碼的蛋白質(zhì)間的相互作用，結(jié)果顯示整個(gè)網(wǎng)絡(luò)以SKP2、ACTC6A、RBX1、BU

14、C、SMARCD1、SKP1、CUL1、BTRC、SMARCC1、SMAP CA4、CDK2、CUL4A、TAF4、CTNNB1、FBXW11蛋白與其他≥10個(gè)蛋白存在相互作用關(guān)系，為此蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)，刪除這些節(jié)點(diǎn)蛋白后，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)渙散。這些基因在不同的癌癥發(fā)生發(fā)展的作用都有文獻(xiàn)報(bào)道，其中SKP2、RBX1、SKP1、CUL1、CUL4A與泛素蛋白酶都有緊密的聯(lián)系，泛素蛋白酶在PD的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮著重要的作用，這些基因也可

15、能作為PD潛在的治療靶點(diǎn)。
　　miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)GSE16658經(jīng)QOE3.0軟件篩選出46個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中上調(diào)5個(gè)，下調(diào)41個(gè)。通過(guò)miRecords對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)獲得靶基因50個(gè)，經(jīng)DAVID對(duì)這些靶基因生物學(xué)過(guò)程分析表明，這些靶基因主要涉及細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)、RNA代謝調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、造血作用、免疫系統(tǒng)發(fā)展、淋巴器官發(fā)展等;分子功能表明，這些靶基因主要涉及細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成、血小板源生長(zhǎng)因子、

16、結(jié)構(gòu)活性分子、結(jié)合生長(zhǎng)因子、結(jié)合SMAD、甲基化轉(zhuǎn)移酶活性、結(jié)合啟動(dòng)子等。通過(guò)KEGG分析發(fā)現(xiàn)，這些靶基因主要參與ECM相互作用受體信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、TGF轉(zhuǎn)化因子信號(hào)通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)移信號(hào)通路等。將這50個(gè)靶基因上傳至STRING在線工具，分析這些基因編碼的蛋白質(zhì)間的相互作用，結(jié)果顯示整個(gè)網(wǎng)絡(luò)以ESR1、CCND1、HDAC4、MYCN、E2F3、CDKN1B、CDK6、SP1、MYB、DNMT3A、DNMT3B、COL

17、1A1、COL1 A2、COL1A1、COL4A1蛋白與其他≥10個(gè)蛋白存在相互作用關(guān)系，為此蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)，刪除這些節(jié)點(diǎn)蛋白后，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)渙散，這些基因可能是PD的關(guān)鍵靶基因。這些靶基因有很大部分是miRNA-30b，miRNA-30c，miRNA-26a的靶基因，而這三個(gè)miRNA在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中大量表達(dá)，說(shuō)明這三個(gè)miRNA可能是帕金森病潛在的生物標(biāo)志物。
　　綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)的方法分別分析了